提高易自聚合蛋白质与核酸相互作用效率的一种简单方法.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 201 1, 38(2): 173~ 176 高易自聚合蛋白质与核酸相互作用 效率的一种简单方法* 王莹 孙达权 刘定干** ( 国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，分子生物学国家重点实验室，上海200031) 摘要 对蛋白质、DNA 和RNA 的相互作用(结合) 的研究是分子生物学的基本课题 多数DNA 和RNA 的结合蛋白都具有自 聚合倾向，在体外实验中会造成难以和DNA 或RNA 形成结合物而影响实验的结果 用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记蛋白质 能显著抑制这种自聚合倾向，而大幅度提高其与核酸分子的结合效率 这一简单 法已用于在细胞角蛋白 18 与转录因子 C/EBP 3忆UTR RNA 结合研究 关键词 抑制自聚合，核酸蛋白相互作用，荧光素异硫氰酸酯(FITC) 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2010.00358 蛋白质和DNA、RNA 三者之间的相互作用是 CK18 具有很强的自聚合、形成团聚物的倾向 这 生物体最根本的生命活动，也是分子生物学研究最 使得CK 18 蛋白只能被保存在含高浓度(8 mol/L)尿 基本的课题 由于这些相互作用最常在细胞内的各 素的缓冲液中，从而对它与C/EBP 3忆 UTR RNA 种生物大分子结合物或细胞器 进行，有关的蛋白 的结合造成了难题 质和核酸分子相互间具有专一的物理接触，这些蛋 为了得到CK18 蛋白与C/EBP 3忆 UTR RNA 白质大多数都具有相互结合或自身聚合的倾向 因 的专一结合物，我们设计了几种方法 这里仅介绍 而，当体外(in v itro)进行有关的机制研究时，这种 其 非常简单的一种，即用荧光素异硫氰酸酯 倾向就使提纯的这些蛋白质和核酸相互作用(结合) (fluorescein isothiocyanate, FITC) 标记 CK18 的 的效率大幅度降低，甚至要得到纳克(ng) 以上数量 法，供同行参考 级的结合产物都很困难[1] 这对于研究它们的功能 1 材料与方法 是一个很大的挑战 因此，研究工作者们也发明了 各种增加蛋白质与其靶分子的体外相互作用效率的 1.1 材料和仪器 方法(例如文 [2]) 这里我们介绍一种降低蛋白质 重组人CK18 蛋白系我组在E. coli 表达和制 自聚合倾向的简单方法 备(人CK18 全长cDNA 为上海肿瘤研究所万大 我们此前已发现，细胞角蛋白(CK) 18 与转录 惠赠) 转录因子C/EBP 3忆UTR RNA ，从其全长 因子C/EBP mRNA 的3 非翻译区(UTR)有专一的 cDNA 克隆(购自Invitrogen 公司)经亚克隆和体外 忆 相互作用[3] 为了具体了解CK18 分子上C/EBP 转录( 使用Promega 公司的RiboMax 大规模制备 3忆UTR 的结合位点，阐明C/EBP 3忆UTR 肿瘤抑 [4-6] 制功能的分子机制 ，需先提纯这个结合位点的 * 国家自然科学基金资助项目, 国家 短肽段，再进行蛋白质质谱分析，这是最简便的 科技重大专项“重大新药创制”(2009zx0930 1-001)和分子生物学国 法 为此，需要制备比较多量的(几微克至几十微 家重点实验室开放课题组运行费资助项目.