λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体.PPT

* * 第三节???????? 大肠杆菌分子克隆载体 一、E.coli克隆载体的种类 1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。 二、质粒与质粒载体 1. E．coli的质粒种类 1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子） 2.质粒的特点 1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中 3.质粒DNA的转移 1）质粒DNA的转移过程 质粒的自主转移过程 质粒DNA的转移和复制 2）质粒转移的必备条件 ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺式 作用（cis-action） ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用 ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用 3）质粒转移类型 ⅰ.自我转移（Self-transmissible） ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。 质粒自主转移 质粒的辅助转移 质粒的重组转移 R-重组DNA分子 ???? 4.质粒DNA的复制和调节控制 1) 复制机制—复制方向、终止和方式 ??? 2) 质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。 3)?质粒的复制调控机制 例子: ColE1质粒的复制及复制起点结构 Boros etal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/ cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因的3端附近发生一次G→T颠换。 ColE1质粒 复制起点结构 质粒DNA的 复制过程 5.大肠杆菌质粒载体 ?? 1) 常用质粒载体的复制子 质粒载体 复制子来源 拷贝数 pBR322系列 pMB1 15-20 pUC系列 pMB1 500-700 pACYC系列 p15A 10-12 pSC101系列 pSC101 25 colE1 colE1 15-20 ????2) 质粒载体常用的遗传标记基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZα ????3) 多克隆位点区 大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的 6.实例—pUC18和pUC19 pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特