碳粉廓清法.DOC

有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验 第一章 检测非特异免疫功能的实验 小白鼠碳粉廓清试验 基本原理 静脉注射一定大小的颗粒物质，迅速被肝、脾等器官内网状内皮细胞吞噬而使其在血浆浓度降低，因此可从其廓清率了解整个单核巨噬细胞系统的吞噬功能。 材料和仪器 印度墨汁 0.1%Na2CO3溶液 毛细滴管 72分光光度计 操作步骤 体重18一22g小白鼠，雌雄各半，随机分为实验组与对照组。 每鼠尾静脉注射印度墨汁0.05ml/kg体重，于l（t1）和5（t5）分钟后分别从眼眶静脉取血20ul，加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀； 用72型分光光度计在680mm下比色,测光密度（以下分别用OD1和OD5来表示l分钟和5分钟所取血样的光密度）； 按下式计算廓清指数K值： 廓清指数K= LogOD1－logOD5 = LogOD1/OD5 T5-t1 4 K值经体重及肝脾重换算后．得吞噬指数α值： 吞噬指数α＝体重／肝脾重× 以X±ＳＤ来表示给药组与对照组的 k值和 α值，进行组间 t检验，比较差异的显著性。 注意事项 　印度墨汁应用生理盐水稀释l一5倍左右。最好经超声处理后离心，弃出沉淀物，以免凝集的碳粒阻塞肺毛细血管，引起动物致死。 　尾静脉注射要熟练，取血时间也可延长至10分钟，但必须准确无误。 参考文献 刘辉　2000　研究生免疫学教程　大连　大连出版社　258-259　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（张璐　刘辉） 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验 基本原理 通过定量地观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，反映小鼠巨噬细胞的吞噬能力。 材料和仪器 5％鸡红细胞生理盐水悬液 37℃孵箱 固定液：1:1?丙酮－甲醇溶液 染色液：4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液 垫有湿纱布的搪瓷盒 操作步骤 1 取体重 18一22g 的健康小白鼠．随机分成给药组试验组、阴性对照组和阳性对照组。 2　每鼠腹腔注射 5％鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml。 3　 8-12小时后,颈推脱臼处死小鼠；正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水2m1，轻轻按揉鼠腹部 1分种，然后吸出腹腔洗液 lml，分滴于两片载玻片上，放人垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30分钟。　 4　以生理盐水漂洗，以除去未粘片的细胞，晾干。 5　1:1?丙酮－甲醇溶液固定5分钟。 6　4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液染色3分钟，用流水冲洗，晾干。 7　结果判定：油镜下计数巨噬细胞，每片 200个按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。 吞噬百分率＝ 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 × 100% 200个巨噬细胞（吞及未吞噬的） 吞噬指数＝ 被吞噬的鸡红细胞 ÷2 ２００个巨噬细胞 在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能．通常分为4级： Ｉ级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄绿色，胞核浅紫红色。 II级；轻度消化。胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。 III级：重度消化。胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。 IV级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐．胞核隐约可见。 注意事项 实验过程中应注意无菌操作。 若筛选免疫抑制药，预先可用巨噬细胞诱导剂，在实验前3—4天，腹腔注射 0.5％淀粉生理盐水溶液，每鼠 0.5ml。免疫增强剂多可激活小鼠腹腔巨噬细胞，并增强其吞噬功能一般不再使用巨噬细胞诱导剂。 若滴片染色过深，可用1％HCI脱色；过浅则可复染。 每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。由小鼠腹腔吸出的液体为出血性渗出液时，不宜使用。 必要时用低渗法溶解胞外红细胞，这样容易鉴别细胞内外的鸡红细胞。 本法简便．但难于测定吞噬速率及其动力学改变，而且费时。 参考文献 巴德年　1998　当代免疫学技术与应用．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，261－263 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（张璐　刘辉） 溶菌酶测定法（光学法） 基本原理 体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，将检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数反映溶菌酶的活性。 材料与仪器 菌种；溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是从空气中分离