免疫-PCR技术探究进展及展望.docVIP

免疫-PCR技术探究进展及展望【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0422－01 【摘要】免疫-PCR是一门新兴的免疫标记技术，具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性，可以同时进行多种抗原／半抗原检测；有更宽的线性范围，在和实时PCR结合后具有更广阔的应用前景。该文对免疫PCR技术的研究进展与展望作一综述。 【关键词】免疫-PCR技术,进展,展望 近年来，荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术已成为免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度并扩大了待测物的检测范围，但对一些微量标本的检测还是不能满足临床和医学研究的需要。PCR技术自1985年问世，它能在短时间内将目的DNA扩大百万倍，具有快速，灵敏，特异的特点，经过十几年的发展，现已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。1992年，Sano［1］等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。免疫-PCR技术正是运用PCR抗原抗体反应的特异性和体外扩增DNA结合在一起的极为敏感的免疫测定技术，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。 ? 一 免疫-PCR的原理 免疫PCR主要由两个部分组成：第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验(ELISA)的抗原抗体反应；第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。免疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫-PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力，只要存在着极微量的抗原抗体反应，PCR都能大量扩增抗体所连接的DNA分子，再用电泳来表明实验结果。免疫-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。免疫PCR通常由4个系统组成：抗原抗体反应，桥联，指示和检测系统。 1 抗原抗体反应系统：1992年，Sano建立了牛血清白蛋白直接包被在酶联板上，利用抗SBA的抗体与之反应，随后又发展出双抗原夹心法和双抗体夹心法的抗原抗体反应系统。 2 桥联系统：指连接抗原抗体系统与DNA分子指示系统之间的连接分子或复合物。目前应用的桥联系统有（1）链亲和素化抗体蛋白A生物素化DNA系统（2）生物素化抗体-亲和素-生物素化DNA系统（3）抗体-叶绿素-DNA系统。 3 指示系统：指标记的DNA分子。研究人员采用了多种指示分子，分为双链DNA和单链DNA。 4 检测系统：有4种方法为（1）紫外透射法（2）放射自显影法（3）标记探针杂交法（4）实时荧光测定法。? 二 免疫-PCR的进展 虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此不能得到广泛普及。Ruzicka［2］等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。此外， Zhou［3］等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。与Sano的免疫-PCR系统相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用［4］。但直接包被待检抗原不适用于临床标本和难以吸附固相抗原的检测。随后在一系列实验中建立了各种夹心免疫-PCR［5-10］，扩大了检测范围。将免疫PCR技术拓展又有磁珠免疫PCR技术和T7-RNA聚合酶扩增免疫技术，但有一定的局限性，磁珠免疫PCR技术特别适用于胆汁，粪便和痰液的病原菌的检测，而T7-RNA聚合酶扩增免疫技术流程复杂，无法进行临床的推广。 ? 三 展望 随着技术的不断进步，免疫PCR也在不断的成熟。免疫-PCR作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性、适合于各种微量抗原的检测［11］，并且可以直接检测细胞上抗原［12］。而且操作简单，实用性强。随着免疫-PCR技术的进一步发展完善，免疫-PCR的功能将得到更充