响应面法优化苏云金芽孢杆菌产耐热蛋白酶发酵培养优化.docVIP

响应面法优化苏云金芽孢杆菌产耐热蛋白酶发酵培养优化[摘要] 采用二水平Plackett-Burman实验设计对影响发酵培养基的8个成分进行显著性分析，确定最重要的3因素为葡萄糖、酵母膏和ZnSO4；应用响应面分析法对这3个因素进行3水平优化，获得它们的最优组合，得到优化后的最佳发酵培养基配方(g/L)：黄豆饼粉12、酵母膏4.24、葡萄糖5.43、KH2PO4 2、ZnSO4 0.39、MnSO4 0.42。优化后产酶水平达到6473U/mL, 与响应面数学模型的预测值仅有0.49%的误差。 [关键词] 苏云金芽孢杆菌 Plackett-Burman设计 响应面分析法 蛋白酶 0 引言 蛋白酶是一种重要酶制剂，广泛应用于食品工业、生物制药工业、化学洗涤剂工业、皮革工业，具有很高的应用前景和商业价值。耐热蛋白酶又因其具有较强的热稳定性而逐渐被人们重视[1]。本文对筛选到的1株产耐热蛋白酶的苏云金芽孢杆菌FS42的产酶培养基进行优化，采用Plackett-Burman实验设计和响应面分析法（Response Surface Methodology，简称RSM）对发酵培养基进行优化，以快速提高该菌株产酶能力。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)菌株FS42，为本实验室保藏菌种。 1.1.2 培养基 （1）斜面培养基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、琼脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2； （2）种子培养基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、琼脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2； （3）始发酵培养基(g/L)：黄豆饼粉1.5g、葡萄糖0.5g、酵母膏0.7g、KH2PO4 0.25g、MgSO4?7H2O 0.035g、CaCO3 0.05g, pH为7.0。 1.2 方法 1.2.1 发酵培养方法 由斜面接一环到50mL(250mL的三角瓶）的种子培养基中，于31℃、230 r/min 的恒温摇床培养13h，制成液体菌种，然后按2%的接种量接入到装液量为35mL(250mL的三角瓶)的发酵培养基中，在31℃、230r/min的条件下进行发酵培养。 1.2.2 Plackett-Burman设计优化 采用多因素二水平的Plackett－Burman试验设计方法，对培养基各成分进行显著性筛选，并进行排序，以期获得三个显著性因素，进行响应面设计优化[2,3]。 1.2.3 响应面设计优化 根据响应面分析法的BOX-Behnken设计，对三个显著性因素进行优化，优化三个因素的最佳水平点，获得最佳优化配方，同时验证[2,3]。 1.2.4 蛋白酶活力的测定 采用酪蛋白（SIGMA产品）为底物，采用紫外分光度法进行测定[4]。酶活力单位定义：在pH 7.2、50℃的条件下每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位（U）。 2 结果与分析 2.1 Plackett-Burman试验设计筛选重要因素 采用Plackett-Burman实验设计对培养基配方各组分（包括：黄豆粉，葡萄糖，酵母膏，K2HPO4 ，ZnSO4?7H2O，MnSO4?H2O，CaCO3，初始pH）进行重要性筛选，确定对产酶影响显著的因素。选择N=12的8因素2水平的Plackett- Burman试验设计，进行培养基优化。以发酵培养基配方的不同组分作为优化输入因子，输入因子X1～X8分别代表黄豆粉，酵母膏，葡萄糖，K2HPO4 ，MnSO4? H2O，ZnSO4?7H2O，MnSO4? H2O，CaCO3，pH，每项均取低(-1)和高(+1)两水平，见表1，响应值Y为蛋白酶的酶活力，表中每列代表每种因素的不同水平。 Plackett-Burman试验的二水平分析目的：在其它因素不变的情况下，分析某因素的变化对响应的影响，从而得出影响培养基组成的主效应因素，结果见表2。结果表明：培养基成分葡萄糖、 酵母膏、初始pH以及ZnSO4?7H2O可信度均大于88.47%，为显著因子，显著性排序为葡萄糖酵母膏初始pHZnSO4?7H2O。 2.2 响应面BOX-Behnken试验设计优化 2.2.1 试验设计与结果 从一阶试验设计Plackett-Burman试验设计结果获得进入二阶试验设计的三因素：酵母粉、葡萄糖和ZnSO4三个显著因子，将三因素设定三水平(-1,0,1)，各水平设计见表3，试验设计及结果见表4，为三因素三水平15个试验点，实施设计后得到试验数据，进行二次回归拟和，得到交互项和平方项的二次方程，分析因素之间的主效应和