重组蛋白的使用和保存方法.PDF

Immune Tech Your Resource for Virology Cancer Research 重组蛋白的使用和保存方法 Immune tech 的重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的 重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的 方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是 用户在实际应用中经常遇到的问题。 1. 原核细胞表达的重组蛋白 大肠杆菌表达的重组蛋白，由于宿主菌缺乏相应的调控机制，细胞内的化学环境与其正常环境有差异，如氧化还原、胞 内pH、以及外源基因的导入，使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长，表达的蛋白质多数以包涵体的形式存在。包 涵体的形成是由于范德华力、疏水作用力和二硫键等作用力形成的，破坏这些作用力比较困难，溶解包涵体时最好加入一定 的变性剂破坏多肽链之间的作用力，才能增加溶解度。蛋白的溶解性与很多因素有关，其中比较重要的是pH 值和离子强度。 很多时候重组蛋白若不能完全溶解，这样所配得的重组蛋白必然有效浓度不够，并且难以保持良好的活性和稳定性。 Immune tech 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶 剂即可，复溶原核表达的冻干蛋白100µg，用86µl 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶 解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。 2. 真核细胞表达的重组蛋白 有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须 在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有 生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。 3. 收到重组蛋白后的操作 收到重组蛋白后，请务必在4℃，12000rpm，离心3 分钟，再打开管盖进行分装、溶解和保存（如果重组蛋白体积小于 50µl，请延长离心时间至5 分钟，以保证全部重组蛋白均离心下来，干粉状态的同样适用）。Immune tech 的重组蛋白使用特 制的储存管，只有在 12000rpm 离心3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的重组蛋白全部离心下来（即使是在 10000rpm 离心 也会离心不完全，导致出现重组蛋白的量不足的现象）。请详细阅读说明书，并按照推荐的保存条件正确保存和使用重组蛋白。 4. 重组蛋白的长期保存 对于Immune tech 大部分重组蛋白，比较合适的保存方式是：分装后保存在-80℃。 （1）对绝大多数重组蛋白来说，都需要保存在-80℃。融化请务必在冰上操作，以尽量降低对重组蛋白的损害。 （2 ）分装可以最大程度的降低反复冻融对重组蛋白的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取蛋白造成的污染可能性。 （3 ）分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于 10µl 每份。因为分装体积越小，重组蛋白的浓度越可能会受到蒸发、枪 头的沾染以及管壁吸附的影响。 （4 ）复融后的分装重组蛋白如果一次用不完，将剩余母液保存在4 ℃，避免再冻起来。重组蛋白工作液应该当天配制当天用 完。 5. 重组蛋白的短期保存 大部分重组蛋白收到后4 ℃短暂保存1~2 周对抗体活性没有影响。如果抗体很快会使用（1~2 周内），推荐在4 ℃保存， 这是为了避免反复冻融对重组蛋白活性的损害，如果要长期保存，则最好是在-80℃。 6. 重组蛋白的运输条件 一般的运输过程需要 1~2 周的时间，所以是在低温4 ℃的条件下来完成的。 4 ℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融 Immune Technology Corp. 0512814 Immune Tech Your Resource for Virology Cancer Research 对重组蛋白的损害，Immune tech 的重组蛋白有非常好的稳定性。 7. 重组蛋白的保护剂 在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8% （质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸