Western印迹中蛋白质定量分析的替代方法-中国细胞生物学学报.PDF

细胞生物学杂志 Chinese Journa1 of Cell Bio1ogy 2007 , 29: 296-298 Western 印迹中蛋白质定量分析的替代方法 王尧尧*税朝祥方秋红 (清华大学第一附属医院中心实验室和内科，北京 100016) 摘要 Westem 印迹广泛采用显像密度计法对特异性蛋白质表达进行定量，但是仍然存在敏 感性的问题尚未解决。同时，昂贵的试剂与复杂的设备限制了其应用。建立了一种改良定量检测 法，使用碱性磷酸酶标记的第二抗体，以蔡盼磷酸盐和快红作反应底物。吸附膜上的终未显色用有 机溶剂洗脱，通过测定光吸收值定量。结果显示该法史简便、快速、经济而不失其敏感性。 关键词 Westem 印迹;蛋白质定量分析 Westem 印迹是利用 SDS- 聚丙烯酷氨凝胶电泳 自制橡皮刮解离细胞，收集样本至1.5 ml无菌离心管， 置-20 C 过夜。复温后剧烈振荡 15 s 促进细胞裂 (SDS)分辨蛋白质样品，再转移至醋酸纤维或 聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride , PVDF)吸附膜上， 解，离心 10 000 g 10 min 去不溶物。上清液中的蛋 白质含量用BCA微孔板法定量I坷，使用牛血清白蛋白 以酶标记的特异抗体直接或间接检测特异性蛋白质 (BSA) 做标准品。 的表达，并分析其相对含量。常用的定量分析法包 将不同浓度的蛋白质样品稀释至终体积为20μl 括使用化学发光剂(chemiluminescence)作为酶反应底 物，经曝光处理在放射性感光胶片上显带，再以显像 的上样缓冲液 (0.5 mo l/L Tris-HCl、 10% 甘油、 2% 密度计(image densitometer) 以及相应的计算机软件进 SDS、 5% 二至在基乙醇及 0.1% 澳酣兰， pH 6.8) , 96 行定量扫描分析川。实践中，我们发现显像密度计 C 加热5 min 变性。分别以3% 和 9% 的 SDS- 聚丙 仍然存在敏感性的问题，所测得的定量指标与蛋白质 烯酷氨为浓缩胶和分离胶，在含有甘氨酸与 SDS 的 样品含量的相关性较差，而且使用化学发光剂和放射 Tris 电极缓冲液( pH 8.3 )中以 200 V 电压电泳45 性感光胶片等材料的费用十分昂贵。相应的特殊设 min。用平板法(Bio-Rad)、含20% 甲醇和 10% SDS 备和计算机软件系统也限制了开展工作的条件。本 的Tris I 甘氨酸缓冲液、 20 V/45 min 转移蛋白质样 文介绍一种碱性磷酸酶(ALP)标记抗体探测、以荼 品至PVDF 吸附膜(Amer由am)上。 PVDF 膜浸泡于 盼磷酸盐与快红做底物的显带法，经有机溶剂洗脱后 封闭液 (0.1 mol/L Tris-HCl、 0.1% 吐温-20 、 1% 可直接对Western 印迹定量分析，方法简便、快速、 BSAl是 5% 马血清， pH 7.6) 0.5 h，与 1 : 2 500 稀释 经济，而且不影响其敏感性。 于Tris-HCl、 0.1% 吐温-20 及 1% 马血清 (pH 7.6) 的鼠抗波形蛋臼 (vimentin) 抗体(中杉金桥公司)在室 温反应 1 h 或4 C 温育过夜。洗涤3 次后加入 1 : 1 材料与方法