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DNA浓度与纯度测定--分光光度法
DNA浓度和纯度的测定--分光光度法 一、目的 熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。 二、原理 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 寡核苷酸浓度约为30μg / ml（youyu底物不同有差异） 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。 经验值： 纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存） OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。OD260/OD2802.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD2302说明去盐不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。 三、材料、试剂及器具 1、 材料 提取的PUC19样品、PUC19标准样品 2、 试剂 灭菌重蒸水，TE缓冲液 3、 器皿 石英比色皿；UV-240紫外分光光度计 四、操作步骤 1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min. 2、 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。 3、 设定狭缝后校零。 4、 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。 5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。 6、 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。 7、 计算待测样品的浓度与纯度。 DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000
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