试验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.DOC

实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳分析技术是目前临床常规测定中应用最广的方法，具有快速、吸附作用和电渗作用小、分离区带清晰、灵敏度高等特点。醋酸纤维素薄膜还可进行透明化处理，便于照相和扫描计算结果。 　　1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。了解电泳法分离蛋白质的临床意义。 pH4.0～7.3之间，pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中都向极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少分子大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质条区带依次分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质含量的百分数。 　 醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽、分光光度计或吸光度计。 【】 1. 巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06) 称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。 2. 氨基黑10B染色液 称取氨基黑10B 0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，蒸馏水至100ml。3. 漂洗液 醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后蒸馏水至100ml。 4. 洗脱液 0.4mol／LNaOH溶液。 5. 透明液 【】 1. 准备 1）。×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约20分钟）用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。 2. 点样 ～μl)，加在点样线上，待血清渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜（图）。 3. 平衡与电泳 盖上电泳槽盖，通电进行电泳。电压为100～160伏，电流0.4～0.6mA／cm宽，待电泳区带展开～3.5cm时断电。 4. 染色 ～α1、α2、βγ-球蛋白（图3-3）。 　 6.定量 (1)洗脱法：取6支试管，编号，分别为A、α1、α2、β、γα1 + α2 + β + γ 清蛋白% ＝ 清蛋白管吸光度×2/T×100 α1-球蛋白% ＝ α1-球蛋白管吸光度/T×100 α2-球蛋白% ＝ α2-球蛋白管吸光度/T×100 β-球蛋白% ＝ β-球蛋白管吸光度/T×100 γ-球蛋白% ＝ γ-清蛋白管吸光度/T×100 (2)扫描法：待染色的醋酸纤维素薄膜完全干燥，置透明液中约3分钟，取出贴于玻片上，薄膜完全透明。将已透明的薄膜放入全自动光密度计中，对蛋白区带进行扫描，自动绘出电泳图，并直接打印出各区带的百分含量。 【注意事项标本不能溶血，否则，β球蛋白浓度偏高。2．每次电泳时应交换电极，以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换，使缓冲液的pH维持在一定水平。 3．电泳槽缓冲液的液面要保持一定高度，过低可能出现了球蛋白的电渗现象(向阴极移动)。同时，电泳槽两侧的液面应保持在同一水平面，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。4．电泳时电泳槽要密闭，以保持湿度，否则，薄膜水分蒸发干燥，使电流下降，分离不佳。5．电泳失败或图谱不理想的常见原因。(1)电泳图谱不整齐：点样不均匀；薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分补给不足；缓冲液变质；电泳时薄膜放置不正，与电流方向不平行。(2)各蛋白区带分离不清晰：点样过多；电流过低，多由薄膜过于致密、吸水性差、导电能力差引起；膜面干燥；薄膜过薄。(3)清蛋白中间着色浅：染色时间不够或染色液陈旧；清蛋白含量过高，可减少血清用量或延长染色时间。(4)电泳速度慢：电流过低；供给薄膜的缓冲液不足，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄(一般需4层)；温度过低，冬季电泳速度较夏季慢；薄膜结构过于致密，导电性差；缓冲液中水分蒸发，致使离子强度增大。6．样品要求点在粗糙面(无光泽面)，否则，样品很难吸人膜内。电泳时最好将点有样品的一面朝下，以防电泳过程中水分蒸发，影响电泳结果。7．染色时间以2分钟为佳(室温低时，时间可稍长)，若时间过长，可使α1球蛋白与染料结合率增加，导致α1球蛋白百分比上升。 α1-球蛋白： 1.76～4.48% α2-球蛋白： 4.04～8.28% β-球蛋白： 6.79～11.39% γ-球蛋白： 11.85～22.97% A/G 1.24～2.3