高效毛细管电泳（HPLC）-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.16.3.2 高效毛细管电泳 （HPLC ）的基本原理 高效毛细管电泳 （high performance capillary electrophoresis ，HPCE ）是近年来发 展起来的一种分离、分析技术，它是凝胶电泳技术的发展，是高效液相色谱分析 的补充。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。 可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPLC 分析高效、 快速、微量。 电泳迁移 不同分子所带电荷性质、多少不同，形状、大小各异。一定电解质及PH 的缓冲 液或其它溶液内，受电场作用，样本中各组分按一定速度迁移，从而形成电泳。 电泳迁移速度(v)可用下式表示： v=uE 其中E 为电场强度(E ＝V/L，V 为电压，L 为毛细管总长度) 。 为电泳淌度。 电渗迁移 电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。特殊结构的熔合硅毛 细管管壁通常在水溶液中带负电荷，在电压作用下溶液整体向负极移动，形成电 渗流。带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。 分离分析类型 根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型：①毛细管区带电泳 （capillary zone electrophoresis ，CZE ）；②毛细管等速电泳 （capillary chromatography，CITP ）；③毛细管胶速电动色谱 （miceller electrokinetic capillary chromatography，MECC ）；④毛细管凝胶电泳（capillary gelelectrophoresis，CGE ）； ⑤毛细管等电聚焦 （capillary isoelectric focusing ，CIEF ）。 毛细管区带电泳 （CZE ）为HPCE 的基本操作模式，一般采用磷酸盐或硼酸盐缓 冲液，实验条件包括缓冲液浓度、ｐＨ值、电压、温度、改性剂（乙腈、甲醇等）， 用于对带电物质 （药物、蛋白质、肽类等）分离分析，对于中性物质无法实现分 离。毛细管胶束电动色谱 （MECC ）为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体 色谱，在缓冲液中加入离子型表面活性剂作为胶束剂，利用溶质分子在水相和胶 束相分配的差异进行分离，拓宽了CZE 的应用范围，适合于中性物质的分离， 亦可区别手性化合物，可用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品 中国试剂网 3.16.3.2 及体液样品的分析。毛细管等速电泳 （CITP ）采用先导电解质和后继电解质， 构成不连续缓冲体系，基于溶质的电泳淌度差异进行分离，常用于离子型物质（如 有机酸），并因适用较大内径的毛细管而可用于微制备，但本法空间分辨率较差。 毛细管等电聚焦电泳 （CIEF ）用于具兼性离子的样品 （蛋白质、肽类），等电点 仅差0.001 可分离的物质。毛细管凝胶电泳 （CGE ）依据大分子物质的分子量大 小进行分离，主要用于蛋白质、核苷酸片段的分离。此外，还有毛细管电色谱 （CEC ）及非水毛细管电泳 （CNACE ），用于水溶性差的物质和水中难进行反应 的分析研究。目前CZE 和MECC 用得较多，本文以这两种方法为例来说明HPLC 的原理。 CZE 的基本原理 HPLC 选用的毛细管一般内径约为５０µｍ（２０～２００µｍ），外径为３７５µ ｍ，有效长度为５０ｃｍ（７～１００ｃｍ）。毛细管两端分别浸入两分开的缓 冲液中，同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得分析样品沿 毛细管迁移，当分离样品通过检测器时，可对样品进行分析处理。HPLC 进样一 般采用电动力学进样 （低电压）或流体力学进样 （压力或抽吸）两种方式。在毛 细管电泳系统中，带电溶质在电场作用下发生定向迁移，其表观迁移速度是溶质 迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗