HPLC梯度洗脱法测定宁神丸中丹酚酸B含量.doc

HPLC梯度洗脱法测定宁神丸中丹酚酸B含量【摘要】目的：建立高效液相色谱法（HPLC）测定中成药宁神丸中丹参的主要成分丹酚酸B的含量。方法：采用Luna C18(2)（5 ?滋m，4.6 mm×250 mm）色谱柱；检测波长286 nm；流动相乙腈－0.4%磷酸溶液，梯度洗脱；流速1.0 ml/min。结果：在0.142628~1.42628 μg范围内具有良好的线性关系，r=0.999997；平均回收率为97.61%，RSD＝1.70%。结论：该法灵敏度高、专属性强、重现性好，并通过对数批样品含量进行考察，可作为制剂质量控制指标之一。 【关键词】宁神丸；HPLC；丹参；丹酚酸B 文章编号：1009-5519（2008）23-3533-02 中图分类号：R28 文献标识码：A 宁神丸是由熟地黄、山药、茯苓、党参、白术、丹参、酸枣仁、枸杞子等中药组成的中药复方制剂。具有养血安神，益气健脾。用于夜睡不宁，怔忡健忘，体弱神疲等。为了更好的控制成品的质量，本实验采用高效液相色谱法（HPLC）对处方中丹酚酸B进行测定，结果如下。 1 仪器与试剂 Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱：Luna C18(2)（5 ?滋m，4.6 mm×250 mm）；丹酚酸B对照品：中国药品生物制品检定所，供含量测定用(纯度：98.5％)（111562-200605）；宁神丸（广州固志医药科技有限公司供应，批号为。乙腈：色谱纯（Fisher sientifics）；水为重蒸水；其它试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件：色谱柱：Luna C18(2)（5?滋m，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈流动相A，以 0.4％磷酸溶液流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；286 nm波长为检测波长。上述条件下，丹酚酸B与其它组分能达到基线分离，分离度，理论板数均符合要求。 2.2 供试品溶液制备方法：取本品适量研细，取约2.5 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，称定重量，超声提取40分钟（功率：45 W；频率：59 KHz），取出，放冷，再次称重，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.3 对照品溶液制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1 ml含丹酚酸B 70 μg的溶液，即得。 2.4 方法专属性的考察：依法制备阴性样品溶液，并按样品含量测定方法操作收集图谱，结果见图1所示，显示阴性对测定成分无干扰，说明本含量测定方法对丹酚酸B专属。 2.5 仪器精密度考察：取同一浓度对照品溶液，按含量测定项下方法重复测定6次，结果见表2。 2.6 线性关系的考察：分别精密吸取浓度为71.314 μg/ml的丹酚酸B对照液2 μl、5 μl、8 μl、12 μl、16 μl、20 μl，按样品含量测定方法项下色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值为横坐标，丹酚酸B的量为纵坐标绘制标准曲线，见图2，计算其回归方程。y=8.53699×10-7x+0（r＝0.999997）见表3。 2.6 稳定性试验：取同一供试品溶液（批号，配制后每间隔2小时测定丹酚酸B的峰面积，结果列于见表4。结果表明供试品溶液在8小时内稳定。 2.7 重复性试验：取同一批号样品，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，并按样品含量测定方法测定丹酚酸B的含量，结果见表5。 2.8 准确度试验：采用加样回收法：精密量取浓度为1.262 mg/ml的丹酚酸B对照品甲醇溶液1 ml（精密称得丹酚酸B（纯度98.5%）对照品12.81 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，即得（12.81×0.985/10=1.262 mg/ml）），置具塞锥形瓶中，挥干甲醇，再精密加入已知含量的供试品样品含丹酚酸B的量为1.073 mg/g）约1.25g，精密称定。照供试品制备方法制备回收率样品溶液6份，依法测定，计算回收率，结果见表6。结果表明，本法具有良好的回收率。回收率计算公式： 3 讨论 3.1 提取方法的选择：根据文献[1]，选择75%甲醇为提取溶剂，药典中丹参药材采用加热回流提取方法提取丹酚酸B，本实验中采用超声提取40分钟，并考察提取残渣，残渣中已无丹酚酸B残留，故采用超声提取。 3.2 有关丹酚酸B含量测定方法文献报到较多，但均为等度洗脱，而本方中，在采用等度洗脱条件时，很难达到基线分离，并且峰形较差，采用本文梯度条件时，丹酚酸B与其它组分能达到基线分离，且峰形好，故选用本文条件。