大豆磷脂中溶血磷脂酰胆碱含量测定方法探究.doc

大豆磷脂中溶血磷脂酰胆碱含量测定方法探究（1.重庆文理学院 化学与环境科学系，重庆 永川 402160；2.四川省江源天然产物有限公司，? 四川 洪雅 620360；3.西藏藏药集团股份有限公司，四川 成都 610041）?? 摘 要：目的：采用HPLC法测定大豆磷脂中有关物质溶血性磷脂酰胆碱的含量。方法：采用C18色谱柱，以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）为流动相，紫外检测器，进样量20μL。结果：大豆磷脂中主成分磷脂酰胆碱和溶血性磷脂酰胆碱能很好地分离检出，LPC线性浓度范围为2.3625μg/mL～189.0μg/mL；平均回收率98.05%，RDS为0.86%（n=6），溶血性磷脂酰胆碱的最低检测限为1.0ng，所含其它物质对检测无干扰。结论：该法准确、灵敏、快捷，可作为大豆磷脂中有关物质溶血性磷脂酰胆碱的测定方法。? 关键词：大豆磷脂；溶血性磷脂酰胆碱；HPLC ? 中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0035-02? 大豆磷脂主要含有磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、胞苷二磷酸（CDP）等。在大豆磷脂原料的制备、纯化及其注射液的制备、贮藏过程中，均会有部分PC分解产生LPC，LPC具有溶血或溶解细胞膜作用，故对大豆磷酯中LPC含量需进行严格控制。目前，对大豆磷脂中杂质LPC含量测定的研究不太多，大多采用TLC和HPLC法。TLC法具有仪器设备简单价廉等优点，但操作烦琐。HPLC法虽具有快速、易于自动化等特点，但所用检测器多采用蒸发光散射检测器和质谱检测器，仪器价格昂贵。针对目前企业单位一般的液相配置的情况，为了快速、简便地测定大豆磷脂中的溶血磷脂酰胆碱，我们选择紫外检测器。? 1 材料与方法? 1.1 仪器和试药? HP1100型高效液相色谱仪；PHS-2C型精密酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；Sartorius211型电子天平；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）。? 溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰胆碱（PC）对照品，Sigma公司；大豆磷脂（含磷脂酰胆碱量90%），实验室自制；甲醇（色谱试剂）；乙腈（色谱试剂）。? 1.2 色谱条件? HypersilC18色谱柱：150mn×4.6mn，流动相：甲醇-乙腈-水（50∶40∶10），柱温：室温，流速：1.0mL/min，进样量：20μL；紫外检测器；进样量20μL。? 1.3 对照品溶液和样品溶液的配制? 取样品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得样品试液。取溶血磷脂酰胆碱对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即对照品溶液。吸取样品试液和对照品溶液各20μL进样，即得。? 2 结果? 2.1 色谱的定性与分离? 以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）为流动相，对大豆磷脂中的磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱能达到较好的分离。本法理论板数按磷脂酰胆碱计为8562；磷脂酰胆碱与溶血磷脂酰胆碱的分离度为5.76，PC的保留时间为17min，LPC保留时间约为22分钟。分离的色谱图见图1。? 2.2 线性范围? 精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品10.50? mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为预试液，分别吸取预试液适量，用甲醇稀释制成浓度为2.3625μg/mL，9.45μg/mL，23.625μg/mL，47.25μg/mL，94.5μg/mL，189.0μg/mL的溶液，分别定量注入20μL，经HPLC法测得峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=4256.9X+3193.5，r=0.9999。结果显示，溶血磷脂酰胆碱在线性范围2.3625μg/mL～189.0μg/mL内，线性关系良好。? 2.3 精密度? 精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品9.12mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品溶液，取此液连续进样5次，按峰面积计算精密度。测得平均峰面积为441169，RSD为0.1%。结果显示，进样精密度良好。? 2.4 回收率实验? 精密称取大豆磷脂样品约12.5mg于50mL量瓶中；再精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品约20.0mg于50mL容量瓶中，制得一定浓度的对照A液，再精密量取对照A液5mL，加入其中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为对照回收液，按1.3项进行测定。再按此方法制得5个