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眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体保护试验[摘要]目的：制备特异性高的鸡眼镜王蛇毒卵黄抗体，并对其进行体外和体内保护试验。方法：用眼镜王蛇毒免疫母鸡，在卵黄中产生抗眼镜王蛇毒抗体IgY，用水溶解法提取IgY，进行小鼠体外中和试验和体内保护试验。结果：体外、体内保护试验显示，6 mg/kg的IgY可有效中和小鼠体内低剂量（≤3LD50）的蛇毒，对致死剂量蛇毒有很好的保护效应。结论：从卵黄中制备的抗眼镜王蛇毒IgY可有效地中和眼镜王蛇毒。 [关键词]卵黄抗体（IgY）；体内保护作用；体外中和试验 [中图分类号]R392 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）07（ｃ）-120-02 传统蛇伤急救药品主要是含有蛇毒抗体的马血清或羊血清，制备程序复杂、成本高，应用受到限制。经研究发现鸡抗体具有从母体传递到卵黄的特性[1]，据此国内外一些实验室正在研发抗细菌毒素和某些动物蛋白的特异性鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）[2]，用于人类疾病的诊断和治疗。本实验室用眼镜王蛇毒免疫母鸡，从卵黄中制备抗眼镜王蛇蛇毒抗体IgY，并在前期工作基础上，对该IgY与眼镜王蛇毒的体外中和和体内保护作用进行研究，进行初步药效学评价，为进一步的应用提供基础资料。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂，Sigma公司出品；巴比妥钠、巴比妥、硫柳汞、琼脂粉等试剂均为市售分析纯。眼镜王蛇毒为淡黄色结晶，由蛇毒研究所提供，NIH小鼠腹腔注射LD50为0.42 mg/kg。 1.1.2 实验动物NIH小鼠，雌雄各半，体重18~22 g，由广州医学院实验动物中心提供（粤检证字2002A046号）。莱杭鸡，雌性，22~24周，购自广州力康公司。 1.2 方法 1.2.1 免疫母鸡每次用眼镜王蛇毒（100 μg/只）采用皮下多点注射法免疫产蛋莱杭母鸡，初次免疫用1∶1（V/V）的蛇毒加完全弗氏佐剂，初次免疫后隔两周进行2次加强免疫。加强免疫用1∶1（V/V）的蛇毒加不完全弗氏佐剂。初次免疫后开始收集鸡蛋，储于4℃冰箱。 1.2.2 分离提纯IgY采用水稀释法提取抗眼镜王蛇毒抗体IgY[3]。按双蒸水∶蛋黄=9∶1的比例溶解鸡蛋黄，调pH至5.1，4℃静置6 h后离心（10 000 g，25 min，4℃）取上清，搅拌加入Na2SO4至终浓度到19%，离心（10 000 g，25 min，4℃）弃上清，将沉淀溶解于80 ml双蒸水，搅拌加入Na2SO4至终浓度到12%，再离心（10 000 g，25 min，4℃）弃上清，重复上述操作3次，最后用80 ml双蒸水溶解所得沉淀，置于半透膜中于4℃透析脱盐；透析后冻干，冻干粉既为粗提的抗眼镜王蛇毒抗体IgY。 1.2.3 双向免疫扩散反应测抗体应用pH8.6、0.05 mol/L巴比妥钠缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，沸水溶化，倒入平放的培养皿中，室温放置15 min，4℃放置10 min。打孔，直径为4 mm，在中心孔加上15 mg/ml的眼镜王蛇毒液20 μl，周围孔加入经水稀释法处理的不同浓度的蛋黄上清液20 μl，37℃温箱中放置24 h，观察结果。留取免疫前鸡蛋作阴性对照。 1.2.4IgY最大保护剂量试验选用NIH小鼠72只，随机分成4LD50（1.68 mg/kg）和6LD50（2.52 mg/kg）两组，各组又分A、B、C三组，每组12只。4LD50组：将4 mg/kg、6 mg/kg及8 mg/kg的抗眼镜王蛇抗体IgY液分别与4LD50的眼镜王蛇毒液在无菌试管内混合，置25℃恒温水浴箱中孵育60 min，然后按组给药；6LD50组：将4 mg/kg、6 mg/kg及8 mg/kg的抗眼镜王蛇抗体IgY液分别与6LD50的眼镜王蛇毒液混合，同上处理后分组给药。记录上述各组48 h内动物的存活率。 1.2.5 IgY对眼镜王蛇毒体外中和试验选用NIH小鼠48只，随机分成4组，每组12只。试验组将4LD50、6LD50及8LD50的眼镜王蛇毒液分别与6 mg/kg粗提抗眼镜王蛇抗体IgY液在无菌试管内混合，置25℃恒温水浴箱中孵育60 min，然后分组给药；对照组：将6 mg/kg未免疫母鸡的IgY液与1.68 mg/kg浓度的蛇毒液混合，同样条件下对另一组小鼠进行腹腔给药，记录各组48 h内动物的存活率。 1.2.6 IgY对眼镜王蛇毒体内保护试验选用NIH小鼠48只，随机分成4组：2LD50、3LD50、4LD50及对照组，每组12只。试验组：将4LD50、6LD50及8LD50的眼镜王蛇毒液分组腹腔注射，10 min后，注射6 mg/kg抗眼镜王蛇抗体IgY液进行抢救。对照组：腹腔注射4LD50眼