骆驼肠道主要细菌分析.docVIP

骆驼肠道主要细菌的分析 立题依据 1.1研究背景 骆驼被称为“沙漠之舟”, 骆驼是骆驼科骆驼属的动物，只有两种，即单峰骆驼和双峰骆驼，鼻孔能开闭，足有肉垫厚皮，适合在沙漠中行走，背有肉峰，内蓄脂肪，头较小，颈粗而长，弯曲如鹅颈。这些特性都与其在沙漠里生存相适应，在沙漠里骆驼的速度一般为 14.5～16公里/小时。 虽然今天单峰骆驼仍约有1千3百万存活，但是野生物种已经濒于灭绝。用于家畜的单峰驼主要见于苏丹，索马里，印度及附近国家，南非，纳米比亚和博茨瓦纳。 　　虽然骆驼曾统治北美一时，但在人类出现在美洲大陆不久后就随同其他曾生活在美洲的大部分物种一起消失了。但是根据路透社报道，近期在叙利亚中部发现的未知巨型单峰驼被认为生活在距今10万年前，令科学家重新审看现代骆驼的起源学说。 　　中国是世界上双峰骆驼主要产地之一，主要分布在内蒙古、新疆、青海、甘肃、宁夏等省区约110万平方公里的干旱荒漠草原上。 与其他草食动物相同，骆驼的消化吸收与肠道菌群有着密切的关系。据报道，乳杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、梭菌、瘤胃球菌是肠道内主要的优势菌属，能有效调节机体免疫、抑制肠道致病菌的生长；梭菌、瘤胃球菌作为常见的纤维素分解菌，在草食性动物纤维素代谢方面发挥着重要的作用；拟杆菌、普雷沃氏菌则与动物胃肠道糖脂等营养物质的消化代谢息息相关。大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌及产气荚膜梭菌作为肠道过路细菌，是造成动物腹泻、内毒素血症等的主要病因。 1.2研究现状 大量研究表明，动物肠道疾病多与肠道菌群紊乱有密切关系。一般动物肠道内存在大量的菌群，其菌种数和菌量维持动态平衡，如果平衡遭到破坏，出现菌群失调，会使其消化吸收功能紊乱而致病。 目前对于骆驼的研究有许多，但具体针对其肠道菌群的研究尚显不足，关于骆驼的研究主要还是集中在对其遗传基因及特性等方面的研究，对其肠道的菌群组成尚不清楚，因此系统的研究其肠道细菌定性定量的关系，对于了解骆驼的肠道消化结构是相当有必要的。 2、研究内容和预期目标 本实验使用传统微生物培养技术，利用已知的选择性培养基对骆驼肠道内常见的有益菌及过路性致病菌进行分离，并对圈养骆驼肠道微生物多样性对比分析和细菌计数，结合特殊功能的生化检测，进一步揭示骆驼肠道菌群组成情况。 3、实验材料和方法 3.1 试验材料 年龄和体重相近的成年圈养骆驼的新鲜粪便。 3.2 培养基 根据已报道的肠道常见正常菌与致病菌种类选择培养基：肠球菌培养基（EC）、优杆菌培养基(ES)、乳杆菌培养基(LbS)、芽孢杆菌培养基(Ba)、酵母菌培养基(Pda)、大肠杆菌培养基（EMB）、沙门氏菌培养基(BS)、志贺氏菌培养基(BS)。 3.3 试剂及仪器 生理盐水、革兰氏染色液、各类糖发酵管、VP试剂、MR试剂、3%的双氧水试剂等。10ml试管、10ml移液管、1ml移液枪、1ml枪头、平板若干、天枰等。 3.4方法 3.4.1采样 成都动物园采集圈养骆驼新鲜粪样，快速转移至无菌采样袋中，冰盒保存。带回实验室后，-70℃冷冻保存。 3.4.2平板及菌悬液的制备 将各培养基按照何明清《动物微生态学》附录的培养基配制方案准确称取各物质，按比例加蒸馏水混匀，高压灭菌后倒置平板备用。 取1g粪样于100ml灭菌生理盐水，用灭菌的玻璃珠分散均匀，备用。 3.4.3分离培养 用移液枪吸取菌悬液0.1ml至各个选择性培养基，如EMB、BS等，涂布均匀。按照下表的培养方法进行培养。 培养基 培养方法 培养时间 （小时） 培养温度（℃） 肠球菌培养基（EC） 需氧 48 37 大肠杆菌培养基（EMB） 需氧 24 37 酵母菌培养基（Pbs） 需氧 24 37 沙门氏菌培养基(BS) 需氧 48 37 志贺氏培养基(BS) 需氧 24 37 优杆菌培养基(ES) 厌氧 48 37 乳杆菌培养基 (LBS) 厌氧 48 37 芽孢杆菌培养基(BA) 厌氧 48 37 以上培养基均为暂定,可根据实验过程需求更换更有效培养的培养基 3.4.4挑取单个疑似菌落进行革兰氏镜检及生化鉴定，确定为何菌。生化鉴定包括：糖、醇类发酵试验、M.R和VP试验、吲哚试验、明胶试验、产生硫化氢试验等。 糖、醇类发酵试验 :用接种针从平板上挑取过夜培养的单菌落，穿刺接种糖、醇发酵固体培养基，28℃静置培养l, 2, 4, 7和14天观察结果。 用接种针从平板上挑取过夜培养的幼龄单菌落穿刺接种葡萄糖氧化发酵培养基试管。每株菌接2管，其中1管用油封盖(凡士林:液体石蜡=1: 1混合后121℃灭菌20min)，约加0.5c m-lcm厚，以隔绝空气为闭管:另1管不封油为开管。同时，还要有两支试管作未接种的空白对照.280C静置培养1,2,4,7甚至14天观