交联酶聚体.pdfVIP

第 １３卷第６期 生　 物　 加　 工　 过　 程 Ｖｏｌ１３ Ｎｏ６ ２０１５年１１月 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｏｖ２０１５ － ｄｏｉ：１０３９６９／ ｊｉｓｓｎ１６７２ ３６７８２０１５０６００５ 交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯合成中的应用 沙　 凤，顾金海，许　 琳，严　 明 （南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京２１１８００） 摘　 要：基于基因组序列数据库挖掘新酶的技术，从白色念珠菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ基因组中克隆了一条新型醇脱氢 酶（ＣＡＤＨ）基因，并在大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达。 为克服游离酶稳定性差、不能重复使用的缺 点，探索并优化了交联醇脱氢酶聚集体（ＣＬＥＡｓ ＣＡ）的制备条件。 结果表明：重组ＣＡＤＨ对底物四氯乙酰乙酸乙 酯（ＣＯＢＥ）的比活力为１８ Ｕ／ ｍｇ，产物（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯（（Ｒ） ＣＨＢＥ）的对映体过量值大于９９％。 ＣＬＥＡｓ ＣＡ沉淀剂选择为６０％饱和度的（ＮＨ ） ＳＯ ，交联剂为 １０ ｍｍｏｌ／ Ｌ 戊二醛。 在固定化操作前，加入 ５０ ４ ２ ４ ＋ ｍｍｏｌ／ Ｌ异丙醇和０１ｍｍｏｌ／ Ｌ ＮＡＤ 对ＣＡＤＨ催化活性位点、辅酶结合位点进行保护，ＣＬＥＡｓ ＣＡ 的活力回收率提 高了４８３％。 将ＣＬＥＡｓ ＣＡ 用于不对称合成（Ｒ） ＣＨＢＥ，经过 １９ 次的重复使用，ＣＬＥＡｓ ＣＡ 的活性仍保留 有５０％。 关键词：（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯；醇脱氢酶；交联醇脱氢酶聚体；固定化 － － － 中图分类号：ＴＱ２２５２４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ ３６７８（２０１５）０６ ００２４ ０６ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ ＳＨＡ Ｆｅｎｇ，ＧＵＪｉｎｈａｉ，ＸＵ Ｌｉｎ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＣＡＤＨ） ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｗａｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ． ＣＡＤＨｗａｓｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）． Ｆｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅｓｕｓｕａｌｌｙ ｈａｖｅ ｐｏｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｒｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｒｅｃｏｖｅｒ ａｎｄ ｒｅｕｓｅ． Ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｓｕｃｈ ｄｒａｗｂａｃｋｓ， ＣＡＤＨｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｓ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ （ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ） ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏ