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第十二章 DNA的复制、修复与重组DNA技术 DNA是储存遗传信息的物质，亲代的遗传信息如何真实地传给子代，这个问题的实质就是DNA分子如何复制(replication)成完全相同的两个拷贝，即DNA的合成，可见通过复制，遗传信息得以在传代中保留。 DNA分子中的遗传信息又如何表达呢？现知基因表达的第一步是通过转录(transcription)，即DNA的碱基按互补配对（G-C，A-T，A-U）的原则转变为RNA分子上相应的碱基序列，接着RNA通过翻译（translation），以三个碱基的序列作为一个氨基酸的遗传密码，从而决定蛋白质的一级结构。不同基因编码不同结构的蛋白质，表现出不同的功能，因而体现出多种多样的生命现象。遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程，是Crick于1958年提出的，称为分子生物学的中心法则(central dogma)(图12-1)。1970年Temin提出“逆向转录”(reverse transcription)扩充了中心法则的范围。 基因或DNA是遗传信息的携带者，在细胞分裂过程中，亲代细胞所含的遗传信息，完整地传递到两个子代细胞。这个过程的实质问题是DNA分子如何复制成完全相同的两个拷贝，有许多酶和蛋白质参与复制过程，通过正确和完整的复制，亲代DNA的遗传信息真实地传给子代，这是遗传信息一代一代传递下去的分子基础，这也是本章的重点内容。但生物体内外环境存在着使DNA分子损伤的因素，因此机体还必须有一套DNA修复的机制。最后还将介绍一些有关重组DNA技术的概念和方法。 第一节 DNA复制的几个基本原则 一、半保留复制 Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制 (semiconservative replication)。用15N标记亲代的DNA链，而用14N标记新合成的DNA链的实验，证实子代的DNA分子，一股链含15N，另一股含14N。 二、半不连续复制 DNA双螺旋的两股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为5′→3′，另一股为3′→5′。那么体内是否存在两种DNA聚合酶?一种催化核苷酸以5′→3′方向聚合，另一种以3′→5′方向聚合。但从现知所有的DNA聚合酶都只能催化5′→3′方向合成。这个问题直到1968年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌DNA复 制过程中出现一些含1000 ~2000个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代DNA分子中那股3′→5′方向的母链作为模板，指导新链以5′→3′方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长1000 ~2000个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿5′→3′合成1 000 ~2 000个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称 为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制(semi-discontinuous replication)，如图12-2所示。复制后，这些冈崎片段由DNA连接酶的作用而连接成完整的新链。 三、RNA引物 目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由DNA连接酶封口。 在DNA的复制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合，而RNA引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用RNA引物，即使出现差错，由于最后将被DNA聚合酶Ⅰ切除，便可提高DNA复制的真实性。 四、复制的真实性 DNA复制过程是非常复杂的，需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既保证DNA复制的速度，又保证产物的高度真实性。这也