dna序列分析的原理与应用-中南大学在线课程平台.docVIP

中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 教 案 授课科目: 授课内容:授课对象：临床医学年制年制授课时数：学时授课：授课地点：授课时间：多媒体教学多媒体课件 图7-1 ATP、dATP和ddATP的结构示意图 图7-2 DNA合成反应模式图 末端终止法：在DNA合成反应体系中，除含有正常脱氧核苷三磷酸底物外，还加入少量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)特殊底物，由于这种底物的5′-磷酸基团是正常的，能够替代相对应的脱氧核苷三磷酸而与引物延伸链的3′羟基连接，进入部分新合成链；但由于这种特殊底物不存在3′羟基末端，故下一个核苷酸底物不能通过5′-磷酸基团与之形成3′,5′-磷酸二酯键，从而导致DNA新链的延伸提前终止于这一“异常”核苷酸处，而掺入的双脱氧核苷三磷酸则位于DNA延伸链的最末端（图7-3） 然而 图7-3 末端终止部位示意图 （二）主要步骤 1.单链DNA模板的制备。 2.DNA模板与测序引物退火。 3.掺入法标记反应。 4.延伸-终止反应。 图7-4 测序反应的基本原理和过程 5．变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 6. 放射自显影。 7.阅读测序结果。 图7-5 末端终止测序反应产物电泳区带放射自显影 二、化学降解法（自学为主） 化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上的。 （一）基本原理 在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段上的位置。然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。 （二）主要步骤 1.目的DNA的制备。 2.单侧末端标记待测DNA片段。 3. 碱基的特异性修饰及化学降解。 图7-6 化学降解G反应模式图 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳。 5.阅读分析结果。 图7-7 化学降解反应产物电泳区带放射自显影示意图 三、DNA序列分析的自动化（主要了解原理） 采用4种带有不同琥珀酰荧光素标记的终止物ddNTPs，可以在同一个反应管中进行末端终止测序反应，并于变性聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。同时，对DNA序列的识读也在电泳过程中完成，即当带有某种荧光素标记的单链DNA片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接收，经计算机分析数据，于记录纸上以红、黑、蓝和绿四种颜色打印出由带有不同荧光素染料标记终止物ddNTPs标示的DNA片段峰谱，继而自动排出DNA序列。 图7-8 荧光偶联法自动DNA测序结果 第二节 核酸分子杂交技术 1969年，Pardue等首先建立了细胞原位杂交技术。 1975年，Southern EM建立了检测DNA的Southern印迹杂交技术。 1977年, Stark GR建立了检测mRNA的Northern印迹杂交技术。 一、核酸分子杂交的原理 核酸分子杂交实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的复性过程。 1. 变性（denaturation） 2. 复性(renaturation) 3. 杂交（hybridization） 二、Southern印迹杂交(Southern blot hybridization) （要求学生重点掌握其原理及基本过程） 1975年，英国爱丁堡大学的Southern EM首创了这一方法，并称之为Southern印迹转移。 Southern 印迹杂交的基本过程。 1. 制备基因组DNA。 2. 用限制性核酸内切酶消化基因组DNA。 3. 适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段。 4. Southern 印迹转移前的凝胶预处理。 5. Southern 印迹转移。 图7-9 Southern 印迹转移示意图 重物 2．玻璃板 3．吸水纸 4．硝酸纤维素膜 5．凝胶 6．滤纸盐桥 7．20×SSC 6. 用标记的核酸探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交。 7. 杂交结果的显示。 三、Northern印迹杂交(Northern blot hybridization) （重点掌握其原理及基本过程） 1977年, Stark GR建立了Northern印迹转移。 Northern印迹转移可以对mRNA进行定性和定量分析，即基因表达分析。Northern印迹转移除了在样品的制备、凝胶电泳分离及凝胶的处理步骤与Southern 印迹转移不同外，其他步骤与Southern 印迹转移基本一致。 四、斑点杂交和狭缝印迹杂交(dot blot