登革热病毒的分子诊断方法taqmanmgb实时荧光rt-pcr快速检测.ppt

登革热病毒的分子诊断方法 TaqMan MGB 实时荧光 RT-PCR快速检测法 登革热简介 登革热，又名骨痛热，是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。 本病于1779年在埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城发现，并据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。 登革热症状 1、发热 2、全身毒血症状 3、皮疹 4、出血 5、淋巴结肿大 登革热的特点 特点： 1、地方性 2、季节性 3、突然性 4、传播迅速，发病率高，病死率低，疫情常由一地向四周蔓延。 登革热的历史 1779年于开罗发生，于巴达维亚（今雅加达）发生 1873年于台湾澎湖县发生 1987-1990南台湾大爆发 1978年5月2日广东佛山石湾镇发现首例病人。 1999年夏季福州市近郊发生登革热流行 2004年福州市台江、连江、闽侯发生局部流行 2001-2006年广东省共报告登革热本地病例2 897例。 登革热的分布现状 全球每年约有五千万宗登革热个案，常见于热带和亚热带地域。　 登革热病毒 登革病毒基因组结构 传播登革病毒的虫媒 埃及伊蚊（Ae.aegypti) 分子诊断方法 1、TaqMan MGB 实时荧光RT-PCR法 2、核酸杂交技术 3、RT-NEST-PCR 4、多重PCR TaqMan MGB 实时荧光RT-PCR法 目前最主要采用的对登革热病毒的快速检测方法。 该方法在2009年成为中国出入境检验检疫行业标准。(SN/T 2301-2009) 技术背景 是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。 于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。 是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。 引物和探针 FAM：荧光报告基团 MGB：荧光淬灭基团 技术原理 技术原理 技术优点 1、特异性更强 2、能有效解决PCR污染问题 3、自动化程度高 4、可实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步，可以实时监控RT-PCR过程。 应用领域 目前该技术主要应用在检测登革热病毒、口蹄疫病毒、马秋波病毒、禽呼肠孤病毒等方面。 展望 1、多重RT-PCR的改进 2、RT-NEST-PCR的改进 3、探针的改进和新探针的发现 * * 2010级生物化学与分子生物学系 刘轩 21620101152316 白纹伊蚊(Ae.albopictus) Den-FP： Den-RP： Den-Probe： 登革热病毒属黄病毒科黄病毒属，病毒呈球形，直径约为45～50nm，最外层为两种糖蛋白做成的包膜，包膜含有型特异性和群特异性抗原，颗粒核心为单股正链RNA。 登革热病毒存在四种表型相近但抗原性差异较大的血清型，分为I、II、III、IV四型。登革热病毒的自然宿主为人类，低等的灵长类和蚊虫。人类感染可引发登革热，严重的可引发登革出血热和登革休克综合征。 Den-FP是上游的引物，而Den-RP是下游的引物。Den-Probe是所用的探针，在其5‘端标记有FAM荧光报告基团，而在其3’端则标记有MGB荧光淬灭基团。 全球每年约有五千万宗登革热个案，常见于热带和亚热带地域。在东南亚部分国家，登革热已成为地方性流行病，国内有输入病例或局部暴发疫情出现。 由一条RNA单链转录为互补的cDNA，由依赖RNA的逆转录酶来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 在常规RT-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。 随着各种先进技术的不断发展，各种高特异性的探针的开发及RT-PCR方法的改进与新的PCR技术的发明，登革热病毒的诊断将会越来越精确、迅速。