乙肝病毒cccdna研究的历史现状及检测方法-缪晓辉.doc

对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的( 乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因组RNA（pgRNA）的模板，对乙肝病毒的循环复制以及感染状态的建立均有十分重要的意义。从cccDNA的角度重新认识HBV感染和清除过程，有助于清现有的一些模糊概念，更深刻地理解HBV的致病机制，更理性地抗病毒治疗的策略和目标，并有可能在移植后肝炎复发的防治等更为深远的领域带来新的启迪。 cccDNA的稳定 cccDNA池 通常认为，HBV感染后细胞核内cccDNA池量相对稳定；但是，这句话不应该被误解为细胞核内cccDNA的量内包膜大蛋白水平调节是动态的作为，cccDNA池的处变化和更新当中，从头合成途径是cccDNA池补充和更新的主要方式[]。HBV的自发突变率能够保持在与HIV相近的高水平、核苷类似物抗病毒治疗后病毒变异现象，明cccDNA池。 cccDNA的 成年人肝脏内肝细胞总数约为2~3×1011个[]，慢性感染状态下这些肝细胞受HBV感染的比例为5%~40%[]；外周血病毒定量为108~1011拷贝/毫升的HBV感染者，肝脏每天要向外周血释放约1.3×101l~1.3×1014个病毒颗粒[]；据此推算，每个受感染肝细胞每天释放到外周血的病毒颗粒数量约为3~3000个。每合成1个病毒颗粒所含的双链核酸即需要cccDNA完整转录1次；此外，每个病毒颗粒内尚含有1个病毒聚合酶，有约180个核壳蛋白、500个表面包膜蛋白（大、中、主），外周血中含核酸的完整病毒颗粒与管形颗粒、小球形颗粒的比例约为1：100：100，000——这些数量巨大的病毒蛋白均需由核内数量有限的cccDNA模板转录生成短寿命的mRNA翻译得来。这就意味着核内cccDNA分子其实是处于频繁转录过程中，在DNA拓扑异构酶作用下经常处于去超螺旋、解双链、转录后重新形成双链结构、再超螺旋化的动态变构过程中；HBV cccDNA作为病毒转录的是一池死水。 cccDNA池究竟有多大？ 既往认为，HBV感染后平均每个细胞核内含有的cccDNA数量在 6～60 之间Zhang[]等利用后天感染DHBV的成年鸭模型，收集从感染后第11天到第131天不同时点的肝脏标本，分离得到单独的肝细胞核，单细胞PCR扩增方法出每个受感染细胞核内cccDNA 的量。发现90%受感染的鸭肝细胞核内cccDNA数量在1～17之间；各个细胞之间cccDNA池含量变化较大，不符合正态分布规律；同一个体在感染的不同时点测得cccDNA池含量不，平均值波动在2.9～8.6之间；许多受感染细胞核内只有1个或数个cccDNA分子，cccDNA池。 该分离细胞核排除了被感染的细胞，真实反应了cccDNA池的大小；利用百分位数描述非正态分布数据，首次揭示“cccDNA池”的分布规律。该研究小组还利用传统定量方法验证得到类似并且更低的结果（cccDNA池含量平均值波动在1.2～6.9之间）；另一研究小组在黑猩猩急性感染活体模型中也得到类似的结果（平均10拷贝/细胞，时间波动）。实验方法的进步可以带来学术观念的更新：cccDNA池即使在数量上也是不稳定的它既非以往认识的那么大，也非以往认为的那么稳，cccDNA池的概念及意义值得进一步探讨。 cccDNA的清除动力学 HBV感染cccDNA的关系，却忽略了一个重要事实，即成年感染HBV后绝大部分（90%～95%）都是自限性的过程在过程中，近乎100%的肝细胞都曾经感染过HBV，然而大部分被感染的肝细胞都通过非溶细胞途径清除了病毒[]或者说，在保全宿主细胞的同时清除了HBV cccDNA。这一过程不仅非常普遍，而且并不漫长（短于6个月？）深入研究其中机制，将为抗HBV治疗带来新的思路。 急性感染中HBV cccDNA的过程 Wieland等利用急性感染HBV的黑猩猩模型，全程观察了肝组织内HBV cccDNA的清除过程[]。急性感染过程中肝细胞内HBV cccDNA数量迅速扩增，平均倍增时间约为3.8～4.2天，大约第7～9周时达峰（平均10拷贝/细胞）；肝细胞HBcAg阳性率增加过程与cccDNA基本同步或稍迟，最高可以达到99%。细胞内cccDNA的清除过程可以分为2个阶段：第一阶段为快速清除期（第8～12周），此期cccDNA清除速度远远快于HBcAg阳性细胞减少速度，表明这是一个非溶细胞性的cccDNA清除过程，并且绝大多数cccDNA在该阶段得到清除（约90%）；第二阶段为慢速清除期（第12周以后），考虑与CTL的细胞毒效应及肝细胞再生有关，约10%左右的cccDNA是在此阶段被清除。总体看来，初建感染状态时cccDNA优先于rcDNA扩增；cccDNA可在很短时间内被消除，表明cccDNA