重组人胸腺肽α1表达与纯化-厦门大学学报自然科学版.doc

重组人胸腺肽α1表达纯化陈清西1 (1.厦门大学 生命科学学院，福建 厦门361102； 2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建 厦门361022) 摘要大肠杆菌重组人胸腺肽α1rhTα1)融合，rhTα1并对其鉴别．于300 L发酵罐发酵表达rhTα1融合蛋白；，离心发酵液收集菌体，经破碎、离心、亲和层析捕获，获得融合蛋白；每升发酵液可获得约170 mg硫氧环蛋白-胸腺肽α1融合蛋白融合蛋白经酶酶切后、经亲和层析、反相层析、体积排阻层析等纯化步骤，获得高纯度rhTα1；通过本纯化工艺获得的rhTα1SDS和HPLC-SEC的纯度均大于99%；采用测定rhTα1活性与市售化学合成胸腺肽（日达仙）标准品一致；质谱分析分子质量为3066.59 u，分子质量大小与去乙酰化的rhTα1理论分子质量(3066 u)一致；N端测序结果与理论值一致说明本工艺可实现工业化规模生产重组人胸腺肽α1蛋白．Q 356．1 收稿日期：2015-03-30 基金项目：国家高技术研究发展（863）计划（2007AA021604） *通信作者：chenqx@xmu.edu.cn 胸腺素α1Thymosin-alpha 1，Tα1）作为免疫调节因子，可以启动T淋巴细胞的成熟，刺激分泌干扰素及各种淋巴细胞介素，以及增强自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性对Tα1的临床研究主要集中在治疗乙型肝炎及丙型肝炎方面，能够显著增强机体免疫力，对肝炎病毒的复制繁殖具有显著的抑制作用 [13]；也有有关Tα1治疗肺癌等肿瘤及其他免疫缺陷疾病的报道[45]．1977年由Goldstein等首次在胸腺组织内发现．人胸腺肽α1是由28个氨基酸组成，N端乙酰化的酸性多肽，其相对分子量为3108、等电点为4.2、分子中有对重复氨基酸残基；氨基酸序列为：N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile- Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C[6]目前人胸腺肽α1生产工艺主要有两种：一种是生化提取法，另一种是化学合成法生化提取材料来源受限，有效成分胸腺肽α1含量低（小于1%），成本高；化学合成的胸腺肽α1虽然已经临床应用，但价格昂贵，在合成过程中污染环境Tα1为主，其销售金额占据国内该类药物93% 的市场份额[7]．采用基因工程技术生产的rhTα1通过查询CFDA暂未有获批产品．有关基因工程技术表达纯化的rhTα1暂时还停留在实验室水平，发酵规模从摇瓶至20 L不等[8,9] ．本文采用基因工程技术，构建高效表达rhTα1的表达菌株，中试规模下，发酵表达并分离纯化，获得高纯度、高活性的rhTα1，为rhTα1产业化大生产打下坚实的基础1.1 材 料 TOP10/ pThioHis A-Tα1 基因工程菌株由本实验室构建并保存；Oxoid公司丙烯酰胺Promega公司；Chelating Sepharose Fast FlowQ Sepharose Fast Flow、SOURCE 30RPC及G-25填料GE公司；Tα1标准品（）购自SciClone；其试剂均为国产分析纯L、300 L全自动发酵罐，B．Braun Biotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，BECKMAN公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；asic 100蛋白纯化仪，GE公司；TOF MS，Bruker公司；N端蛋白分析仪，岛津公司；1.2 方 法 rhTα1 融合蛋白的发酵表达 取rhTα1TOP10/pThioHis A-Tα1，按1：400（）接种150 mL LB培养基/1000 mL三角瓶，37 ℃、200~250 r培养6~8 h为一级种；一级种子按1：200（）接种至24 L LB培养基/30 L种子罐，37 ℃、200~250 r培养6~8 h为二级种 二级种按1：6（）接种到含150 L LB培养基的D300发酵罐中，37 ℃，DO 3060%培养待菌液浓度达OD600nm=3.0，用含1 mmol/L IPTG的氮源补料液1.5 L2 h内流加诱导，过程中补加碳源或2 mol/L NaOH以维持H 7.0，诱导总时长约 h． 1.2.2 菌体收集发酵完毕，离心收集菌体，菌体用pH 8.020 mmol/L NaCl，50 mmol/L TrisHCl缓冲液重悬后采用35 MPa高压破碎次；再用高速冷冻离心机以10℃，10000 r离心40 min，获