实验-两对半的检测.pptVIP

ELISA检测“乙肝二对半”  (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA)   酶免疫技术分类 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 ELISA的概念 酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 酶联：抗原或抗体的酶标记。 免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。 吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。 在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底 物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的 抗原或抗体的量直接相关。  ELISA技术特点 具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床需要，应用广泛。 操作简单、无需昂贵的仪器投入，价格便宜。 对环境几乎没有污染。 ELISA技术的应用 检测抗原的方法： 双抗体夹心法 竞争法 检测抗体的方法： 双抗原夹心法 间接法 竞争法 捕获法 实验目的 掌握ELISA法检测“乙肝二对半” 的原理、操作步骤及注意事项。 掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。 什么是“乙肝二对半”？ “乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb） HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性 保护性抗体： HBsAb 传染性指标： HBeAg ， HBcAg HBeAb， HBcAb不是保护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要指标。 为什么不检测核心抗原（HBcAg） HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。 机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的HBcAb,与HBcAg 形成免疫复合物。 血清中， HBcAg可丢失部分氨基酸。 “乙肝二对半”的检测原理 HBsAg：双抗体夹心法 HBsAb：双抗原夹心法 HBeAg：双抗体夹心法 HBeAb：中和竞争法（血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗原） HBcAb：竞争抑制法 双抗原（体）夹心法测抗体（原） Anti-HIV, Anti-HBs 双抗体夹心法 双抗原夹心法 HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2 双抗体夹心法测抗原 + - E 竞争抑制法测抗体 包被抗原 Anti-HBc Anti-HBe 中和竞争法测抗体 Anti-HBe 试剂盒组成 包被反应板：固相的抗原或抗体 酶结合物：酶标记的抗原或抗体 显色剂：分A、B二瓶 终止液 对照：阳性对照，阴性对照 浓缩洗涤液 中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才有） 实验准备 配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液。 为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb）组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。 实验操作 1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释）。 2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul 3、加酶结合物：每孔50ul 4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟 5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一定要拍干） 6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混匀后置37°C水浴10分钟 7、中止显色：每孔加入中止液50ul 8、判断结果： ①目测法： 反应孔 颜色 结果 阴性对照 透明无色 阴性 阳性对照 黄色 阳性 样品 黄色 ？？ 样品 浅黄色 ？？ 样品 透明无色 ？？ HBsAg， HBsAb， HBeAg HBeAb ， HBcAb 反应孔 颜色 结果 阴性对照 黄色 阴性 阳性对照 透明无色 阳性 样品 黄色 ？？ 样品 浅黄色 ？？ 样品 透明无色 ？？ ②比色法：波长450nm读取各孔OD值 HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值≥2.1 HBeAb ， HBcAb 阴性对照OD值/样品OD值≥2.1 （建议双波长比色（450/630nm）；临界值的确定请参考实验指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同） 阳性 阳性 ELISA的注意事项 标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等） 外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等）（P229）