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微生物酯酶应用 ０引言 酯酶（Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．Ｘ）是一种催化酯键水解和合成的酶的总称，水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质．它广泛存在于动物、植物和微生物中．动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源．１８３４年Ｅｂｅｒｌｅ在兔胰脏中首次发现脂肪酶，微生物酯酶则以１９３５年Ｋｉｒｓｈ发现产脂肪酶的草酸青霉（ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＯｘａｌｉｃｕｍ）为最早．由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，微生物酯酶得到关注，并且已经广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性或者对映选择性，它是合成手性化合物（如手性药物，农药等）的高效生物催化剂，微生物酯酶已成为研究热点． １微生物酯酶的组成及来源 １．１酯酶的组成 酯酶主要包括脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ，ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．３）和羧酸酯酶（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｓ，ａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．１）［１－２］，两者在生化方面没有本质区别，只是在底物特异性上，羧酸酯酶倾向于水解酰基链长度小的底物（le;１０），而脂肪酶倾向于水解酰基链长度大的底物（ge;１０）［３－４］，在结构上，酯酶属于alpha;／beta;水解酶超家族，具有Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ构成的催化中心三组合（ｃａｔａｌｙｔｉｃｔｒｉａｄ），其中Ｓｅｒ通常位于具有保守的Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｓｅｒ－Ｘａａ－Ｇｌｙ五肽结构内［１－２］．细菌脂肪酶又包括八大家族：ｔｒｕｅｌｉｐａｓｅ，ＧＤＳＬ，ＦａｍｉｌｙＩＩＩ，ｔｈｅｈｏｒｍｏｎｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｐａｓｅ（ＨＳＬ），ＦａｍｉｌｙＶ－ＶＩＩＩ，其中ｔｒｕｅｌｉｐａｓｅ又包括７个亚族ＳｕｂｆａｍｉｌｙＩ．１－Ｉ．７［２，５］．阿魏酸酯酶（Ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｅｓｔｅｒａｓｅ，ＥＣ．３．１．１．７３）又称为肉桂酸酯酶，是最近分离出一种酯酶，它是羧酸酯水解酶的一个亚类，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键［６］． １．２微生物酯酶的来源 在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，从分类上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、链孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等１２属２３种；其次是细菌，在细菌中主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属以及伯克霍尔德菌属等；另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶．２产酯酶微生物的筛选及酶活力的测定一般筛选流程为：样品rarr;富集培养rarr;平板分离rarr;平板初筛（观察透明圈）rarr;摇瓶复筛（测酶活力大小），三油酸甘油酯是产酯酶微生物初筛加入培养基中的常用底物，因为初筛选用平板培养基，而在培养基中存在不互溶的油、水两相，所以要对它们先进行乳化，乳化剂可选用聚乙烯醇或者吐温．溴甲酚紫由于反应后ｐＨ变化显色，而ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ由于可以和分解后的物质结合形成显色物质，它们被用作常用指示剂加入培养基内［７］．对于酯酶活力的测定，常见方法有以下几种：酯酶活力比色法，即以对硝基苯酚为底物，分光光度计测定４００ｎｍ处吸光度值［７］；酯酶活力滴定法，以ＮａＯＨ滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下释放的醋酸来测定；alpha;－乙酸萘酯比色法，即先绘制alpha;－萘酚标准曲线，然后在ｐＨ１０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中，以alpha;－乙酸萘酯为底物和粗酶液反应，在５９５ｎｍ处测其吸光度值［８］． ３微生物酯酶与基因克隆 随着分子生物学和宏基因组学的发展，越来越多的研究人员从不同环境样品中筛选产酯酶微生物，克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌为进行后续的工业化生产打下基础．其中的环境样品的主要来源是土壤以及海洋，特别是海洋环境样品，因为海洋环境包括低温、高温、高静水压、强酸、强碱以及营养条件极为贫乏的各种极端环境，微生物要在这样的环境中生存，生理结构、代谢方式等都会发生一系列改变，所以从海洋中筛选到的微生物可能具备某些特殊的代谢产物，另外低温酯酶的研究也十分广泛，近年来已纯化或克隆表达了从南北极、深海、高山冻土中分离到的低温微生物产生的低温脂肪酶，如菌株ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉＩＦＯ３４５８（ＰＦＬ），Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＫＢ７００Ａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｂ１１－１，Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＰＢ４的脂肪酶［９－１２］．郑鸿飞等［１３］从青岛前海和胶州湾海区样品中分离到１株产酯酶活力和稳定性较高的菌株ＥＢ２１；邵铁娟等［１４］从２０００多份渤海海区海泥样品中分离出一株新型脂肪酶高产菌株Ｂｏｈａ