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基因工程的基本过程及应用 一、基因工程的工具 1、比较限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和解旋酶 ? 作用底物 作用部位 形成产物 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 黏性末端或平末端 DNA连接酶 DNA片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 子代DNA DNA解旋酶 DNA分子 碱基对间的氢键 形成脱氧核苷酸单链 （1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。 （2）一般情况下，用同一种限制酶切割目的基因和载体，目是产生相同的黏性末端。 　　但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。 2、对载体的分析 条　件 目　的 稳定并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于重组DNA的鉴定和选择 易错警示：基因工程中的载体与细胞膜上载体的区别： 基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 二、基因工程的操作步骤 ? 1、目的基因的获取 　 　化学合成法：适用于分子较小，序列已知的基因。 2、基因表达载体的构建 （1）组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。 　注意：启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）； 　　　　　终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。 　　　　目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。 （2）构建过程 ? 3、将目的基因导入受体细胞 ? 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法（用Ca2＋处理） 受体细胞 受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞 易错警示： 　　对受体细胞模糊不清： 　　受体细胞常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞，以确保被改造个体所有细胞都含有目的基因）、微生物（大肠杆菌、酵母菌）等。 　　要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌（需内质网、高尔基体的加工、分泌）。 　　唯一不涉及到碱基互补配对的是步骤3。 4、目的基因的检测与鉴定 三、基因工程的应用 1、乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较 比较项目 乳腺生物反应器 工程菌 基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌或酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等，产生的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 哺乳动物的受精卵 微生物细胞 生产条件 不需严格灭菌，温度等条件对其影响不大 需严格灭菌，需严格控制工程菌所需的外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞中提取 2、基因治疗与基因诊断 ? 原理 操作过程 进展 基因 治疗 基因表达 把正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗 临床实验 基因 诊断 碱基互补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 临床应用 3、基因工程与蛋白质工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→推测相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 生产自然界中没有的蛋白质 一般是生产自然界中已有的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过基因修饰或基因合成实现。 ? 典型例题剖析 1、如图所示为部分双链DNA片段，下列有关基因工程中工具酶功能的叙述错误的是（　　） A．切断a处的酶为限制酶 B．连接a处的酶为DNA连接酶 C．切断b处的酶为DNA解旋酶 D．连接b处的酶为RNA聚合酶 答案：D 解析： 　　限制酶能识别特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，通常形成黏性末端，即能切割DNA链外侧的磷酸二酯键（图中的a处），内侧碱基对之间的氢键（b处）可通过DNA解旋酶水解。DNA连接酶将切断的磷酸二酯键进行连接，即图中的a处。RNA聚合酶的作用是催化DNA的转录。 2、若要利用某目的基因（图甲）和P1噬菌体载体（图乙）构建重组DNA（图丙），限制酶的酶切位点分别是Bgl（AGATCT）、EcoR（GAATTC）和Sau3A（GATC）。下列分析合理的是 （　　） A．用EcoR切割目的基因和P1噬菌体载体 B．用Bgl和EcoR切割目的基因和P1噬菌体载体 C．用Bgl和Sau