人血管内皮细胞生长因子基因克隆.docVIP

人血管内皮细胞生长因子基因克隆、表达与纯化 目的研究人血管内皮细胞生长因子121(hVEGF121)基因在pET-24a(+)中的表达，获得高效表达、具有生物学活性的rhVEGF121。方法提取人原髓白血病细胞(HIY30)总RNA，RT—PCR扩增hVEGF121基因，经DNA序列分析后，克隆于高效原核表达载体pET-24a(+)，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，超滤复性，DEAESepharose Fast Flow阴离子交换和Sephacry S-100分子筛色谱纯化后，以HUVEC测定其生物学活性。结果SDS—PAGE结果显示，目的蛋白质以包涵体形式存在，表达量达菌体总蛋白质的20％，纯化后rhVEGF121纯度达95％以上，生物学活性检测证实，具有刺激HUVEC增殖的功能。结论在原核系统中实现了hVEGF121的高效表达。人血管内皮细胞生长因子诱导表达超滤复性 人血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor , VEGF) 是一种主要作用于血管内皮细胞的生长因子,具有促进血管内皮细胞增殖、诱导血管生成和增加血管通透性等多种功能[1 ] 。早期亦称作血管通透因子（英文：vascular permeability factor，简称：VPF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子（heparin-binding growth factor），可在体内诱导血管新生（induce angiogenesis in vivo）。VEGF ,在临床上具有较好的应用前景。我们在大肠杆菌中高效表达了VEGF ,并通过纯化、复性。人的VEGF蛋白是于1989年由美国的两间生物科技公司的科学家分别成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列，证明VPF与VEGF是同一基因编码的同一蛋白。VEGF有六个等型（isoforms）：VEGF-A, -B, -C, -D, 及-E；其分子量从35至44kDa不等，每个等型特异性地与三个“血管内皮生长因子受体”（VEGFR-1, -2, 及-3)的特定组合相结合。 VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白。二条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。VEGF分解的单体无活性,去除N 2糖基对生物效应无影响, 但可能在细胞分泌中起作用。由于mRNA不同的剪切方式，产生出分别VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性VEGF基因的获得与克隆 2.1.1 查找VEGF基因序列 登陆，选择nucleotide，搜寻vascular endothelial growth factor,VEGF, mRNA，即可得到VEGF mRNA 全长序列如下： 1 gatatcagga tgacgcagag tccaagctct ctgtctgcct ctgtggggga cagggtgact 61 attacttgtc gggcatcaca gagtatctcc agctacctta attggtacca gcaaaagccc 121 ggcaaagccc ccaaattgct gatttacgca gccagctccc ttcagtctgg cgtccctagc 181 cgcttctccg ggagcggatc aggcacagac tttacgttga caatcagttc tctgcagccg 241 gaggattttg ccacttacta ctgtcaacag agctacagta cgcctctcac gtttggcggt 301 gggacaaagg tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccga ctgtgtccat cttcccacca 361 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 421 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 481 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 541 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 601 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt // 其CDS为序列121，（上述序列加粗部