实验三RNA的提取检测与定量PCR.docVIP

实验三 RNA的提取、检测与定量PCR 实验RNA提取（Trizol试剂法） ?完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。RNA 的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调节和 cDNA 的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot，RT-PCR 和 cDNA 文库的构建等分子生物学实验都至关重要。所有的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源酶的有效抑制；：有效地将从和蛋白混合物中分离；：对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA的提取目前主要两种途径，1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少 RNA 酶的污染。 实验目的：学习 RNA 的简易制备过程，通过RNA电泳带评价 RNA 质量 实验材料：幼嫩叶片实验原理：Trizol是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液。异硫氰酸胍是目前认为最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。不仅可直接用于从人类、动物、植物、细菌等细胞或组织中提取总RNA，而且还可以从样品中提取DNA或蛋白质。纯化的总RNA完整性好，不受、DNA的污染。可用于Northern杂交、RNA点杂交、poly(A)+ mRNA的分离、体外转录、RT-PCR、RNase封阻分析以及分子克隆。焦磷酸二乙酯（DEPC）是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。采用Trizol法提取RNA，操作过程要戴双层手套，并在超净工作台上操作。 (1) 将研钵和研磨棒洗干净，烘干后在冰箱中-20℃预冷； (2) 冷冻离心机12000 rpm，15 min，并fast cool至4℃； (3) 准备试剂：TRIzol试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇（in DEPC水），不含RNase的无菌水（用DEPC水处理过）；℃加热使沉淀完全溶解。 (4) 分别剪取幼苗的叶，在电子分析天平上准确称取0 mg用以提取RNA； (5) 均化以液氮预冷研钵至研钵里的液氮不再沸腾；将剪取的各组织迅速放入液氮中并迅速研磨待组织变软，再加少量液氮，再研磨，至完全粉末状，L Trizol，继续研磨，直到均一相液体，转至mL 离心管中；(6) 4℃ 12, 000 rpm离心10分钟，取上清至新管中。 () 相分离：上清室温放置5 min。加入0.2 m氯仿振荡混匀15s后室温放置3 min，4℃ 12, 000 rpm离心15。取最上层水相转移至新管，大约为起始加入Trizol 体积的60%。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂；千万不要吸取中间界面(8) RNA沉淀往水相里加入0.25 m异丙醇及0.25 m浓盐沉淀液（0.8柠檬酸钠和1.2 NaCl）以沉淀RNA。混匀后室温放置10，4℃ 12, 000 rpm离心10。RNA沉淀于底。 () 漂洗RNA：加入1m 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃ 8, 000离心5 min，尽量弃上清。 () RNA溶解：室温干燥0 min左右用0 μL RNase-free H2O溶解RNA，。 (1) 用浓度测定仪测定RNA的浓度（1 μL + 9 μL不含RNase的无菌水）。μg/ml=OD260/0.022，或1OD260≈40μg/ml 纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。-70℃保存备用。实验 RNA 的电泳 实验原理：因RNA是单链分子，必须消除局部区域形成的二级结构，在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小，因而需使用变性胶进行电泳；另应特别注意防止RNA的降解。 实验材料：RNA 实验步骤： 1．用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。2． Agarose 1.2 %g?Agarose加72 mL灭菌的DEPC水，加热融化，冷却至70℃MOPS buffer10 mL，37％的甲醛 mL，，通风橱中放1hr。3．准备电泳液：1×