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海 南 大 学 毕 业 论 文（设计） 题 目： 花狭口蛙海南亚种(Kaloula pulchra hianana)皮肤组织cDNA文库的构建 学 号： 20060834021 姓 名： 程 婷 婷 年 级： 四 年 级 学 院： 海 洋 学 院 系 别： 制 药 工 程 系 专 业： 制 药 工 程 指导 教师： 张 英 霞 完成 日期： 2010 年 5 月 5 日 摘 要 目的：在两栖动物尤其是蛙皮肤中已分离得到多种生物学活性物质，我们构建皮肤cDNA文库，有助于筛选活性组分，并保存其功能基因。研究方法：以花狭口蛙皮肤组织为材料，根据Trizol 法提取皮肤总RNA后，使用 Creator? SMART? cDNA 文库构建试剂盒运用SMART ( switching mechanism at 5′end of RNA transcript) 技术构建文库经反转录反应合成cDNA第一链LD-PCR 法将第一链产物扩增再合成双链cDNA双链cDNA经蛋白酶K和SfiI消化后用CHROMA PIN - 400 柱分离双链cDNA将合适大小的ds cDNA 通过T4DNA 连接酶16 ℃过夜孵育连接到经过相同酶切的pDNR-LIB载体中DH5α宿主菌构建形成原始文库，进行滴度测试。结果：构建的花狭口蛙皮肤cDNA文库原始文库滴度为1.18×108 PFU/mL插入片段没有特异性。结论：构建的文库，不用于大规模的功能基因分析。 cDNA文库；SMART技术；花狭口蛙皮肤 Abstract Objective: In amphibians, especially in isolated frog skin, has a variety of biological active substances, We constructed cDNA library of the skin, helps to screen the active component, and maintain its functional gene.Methods:The cDNA library of Kaloula pulchra hianana skin tissue was constructed by Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit. Total RNA was extracted by Trizol ,followed by constructing cDNA library of Kaloula pulchra hianana skin by SMART( switching mechanism at 5′end of RNA transcript) technology : the first strand cDNA was synthesized by reverse transcript ,followed by producing the second strand and double strand cDNA by LD - PCR ;the double strand cDNA was digested by proteinase K and SfiI and then the different size cDNA was isolated by CHROMA SPIN - 400 ; some ds cDNA was transferred into the pDNR-LIB vector at 16 ℃overnight and then was transformed into DH5α to construct the cDNA library.Results: The titer of the cDNA library was estimated as 1.18×108 PFU/mL. PCR results showed th