核桃花芽RNA提取与其cDNA基因克隆研究.docVIP

核桃芽总RNA提取及其cDNA基因克隆研究 宋艳波1 ，梅霞1，吴国良2 ，牛洪斌 3 （1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷，030801；2.河南农业大学园艺学院，河南郑州；3.河南农业大学小麦工程技术研究中心，河南郑州） 摘要：由于核桃富含酚类和多糖等次生代谢物，造成从核桃体内提取RNA非常困难，影响了采用分子生物学技术对核桃的进一步研究。为了进行核桃成花基因克隆研究，本文对核桃芽体内总RNA提取的方法进行了系统研究。研究结果表明：在研磨时添加PVPP并且使用pH 9.0硼砂缓冲液的改良SDS法和改良CTAB法均能从核桃芽体内获得完整的RNA；经反转录获得cDNA可进行基因克隆。说明采用本方法提取的RNA纯度和完整性良好，为核桃芽发育有关的后续分子生物学研究奠定基础。 关键词：核桃；芽；RNA提取；硼砂；PVPP Walnut buds Total RNA Extraction and cDNA cloning research Song Yanbo 1, Mei Xia1, Wu Guoliang 2, NiuHongbin3 (1College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu, 030801, China; 2, Henan Agricultural University, College of Horticulture, Zhengzhou, Henan Province; 3,Henan Agricultural University wheat Engineering Technology Research Center, Zhengzhou, Henan Province) Abstract: Extracting high-quality total RNA from walnut buds is a complicated and rigorous precess as the walnut tissue is rich in phenolic compounds、polysaccharides and other secondary metabolites, this may influence the follow-up molecular biology research. In this paper, we discussed different extraction method of Walnut buds and obtained a effective method. The results showed that added PVPP to the grinding and the use of modified SDS method of PH9.0 sodium borate buffer and the modified CTAB method can extract walnut buds RNA well,and we got the target fragment with the reaction of RT-PCR.So we can acquire the conclusion that our method about extracting walnut bud RNA is available to be used for the research ahout Walnut’s flowering gene . Keywords: walnut; bud; RNA extraction; sodium borate; PVPP 多糖和多酚等次生代谢物质在核桃体内广泛存在，尤其是酚类化合物的含量较高，极易被氧化成多醌类物质进而与RNA发生不可逆结合；另外，多糖在提取过程中和RNA容易形成难溶的胶状物共沉淀[1]，导致得到的RNA产量降低，并丧失应有的生物活性[2]。因此，彻底去除糖类和酚类化合物的干扰，是核桃RNA提取过程中优先考虑的因素。目前，关于核桃总RNA提取研究的相关报道较少[3-5]，为了寻找经济高效的核桃芽体内的RNA提取方法，本文在前人试验研究[4,6]的基础上对RNA提取方法进行筛选和改良，总结出较为实用的核桃芽总RNA提取方法，为研究与核桃成花有关的基因及成花机理，缩短童期加速育种进程等方面的工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 本试验材料选自以山西省汾阳市核桃种苗基地，于2009年3-4月选取生长健康饱满的核桃芽，置于液氮中带回实验室，在-70℃超低温冰箱中保存备用。 1.2 试剂和器皿的准备 RNA 提取中所用的试剂均是新购买的，且用经