真核生物cDNA全长的克隆.docVIP

获得真核生物cDNA全长获得真核生物cDNA全长1．获得真核生物cDNA全长总的思路分离基因一般就从中心法则DNA、rna、蛋白质的三个层次入手做工作。随生物信息学的发展，电脑克隆基因也称为新兴的技术。从题目获得全长cDNA的要求上讲，即使上述几个途径得到的是基因片断，现有的途径也是可以完成cDNA全长的获得的（如下图示）。因此，cDNA全长的获得是技术上可以解决的问题，而目的基因的寻找，特别是未知功能的基因的克隆是比较关键的问题，下面就基因克隆的方法做一简要介绍：2．基因克隆的方法简介2-1．基因克隆的方法策略选择原则从表3中可见分离克隆基因基本上有三种类型：即三中不同的条件，可根据欲克隆的目的基因选择条件选择相应的方法。类型i已知基因的序列（1）已知DNA序列，包括三种情况，一是已知目的基因的DNA全部或部分DNA序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的DNA序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cDNA全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。在这两种情况下一般采用PCR技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。 类型ii已有基因图位或标记，转座子等条件，分别可采用转座子标签法、t-DNA标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。( 类型iii为止目的基因序列(（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和ddrt-PCR、ssh-PCR、rap-PCR、DNA-rda、cDNA捕捉法等进行克隆。（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行，是难度较大较繁琐的策略。从 基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。从cDNA 文库或基因组文库中调取目的基因。第二种类型是表型克隆。是近年来发展十分迅速的一类方法，例如差异筛选法、差减杂交（sh）、mrna差别显示技术 （ddrt-PCR）、代表性差异分析（rad）抑制型差减杂交（ssh）等。第三类是无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件， 常用图位克隆和转座子标签法克隆。2-2．选择基因分离克隆方法的条件 若已从一种生物甚至微生物中分离到某个基因，就可以根据此基因的核苷酸序列特点，利用序列克隆法从另一种生物中分离出这个基因，这虽然是一种较快速有效的方法，但该基因的功能可能已知，原创性不强。( 若一个基因所表达的蛋白质能被分离和纯化，则可利用功能克隆法分离这个基因，功能克隆法的主要限制因素是大多数基因的产物至今仍不清楚，即使知道了也需纯化足够的蛋白质或提供氨基酸测序或制备抗体。( 若一种植物的转座子研究的很清楚，或通过转化较容易获得，则可利用转座子标签法分离此基因。尽管利用转座子标签法已分离了不少基因，由于可供利用的转座子种类太少，转座子的转化并非易事，且在不同植物间转座频率差异很大，目前的应用主要局限于拟南芥、玉米等。(( 若想分离控制缺失突变体表现型的基因，则可利用消减杂交法。消减杂交法是在微生物研究领域发展起来的，在植物中应用此法首先通过诱变等手段获得确实突变 体，应用范围较狭窄，同时消减杂交步骤繁琐且费时费工。若从突变体库中筛出突变体，在满足图为克隆的条件下还可以用图位克隆（见下）。( 若要分离的基因已被定位在分子连锁图上，且离分子标记足够近，则可利用图谱分离法分离该基因。图谱分离法已成功应用于许多基因的分离。但首先应采用各种方 法对目标基因（包括前述突变基因）进行定位，在结合染色体步移和筛选yac文库等才能分离基因，因而难度大、时间长、花费大。( 若要分离差异表达的基因，则可利用cDNA-rapd、dd-PCR、rd和ssh等差异表达分析法。其中dd-PCR是应用最广泛的一种，并已分离了许 多基因或cDNA片段，其不足之处主要是高的假阳性率和短小的差别显示片段。高的假阳性率可以通过各种手段排除，差异显示的片段较短问题显得较突出。 ddrt-PCR使用了锚定引物t12mn，许多差异显示的条带仅显示了3’端非转录序列，即3’-utr序列，因而用差异片段筛选cDNA文库可能筛选 不到目的基因。相反，cDNA-rapd则可对整个cDNA进行差异鉴定，显示的差异条带较长，且包含编码区的可能性大大提高；尽管rapd的重复性有待 改进，但通过优化反应参数和扩增条件，其重复性则可以保证；若改用cDNA-aflp，则可以完全克服这一缺点。rda是在差减杂交和ddrt基础上发展 起来的，它避开了差减法杂交的复杂操作过程，简化了操作程序，同时PCR引物较长，