细胞因子的常识.doc

重组 HYPERLINK 细胞因子概述 ? 一、细胞因子的概念 细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。 二、 HYPERLINK 细胞因子的特征 1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。 三、细胞因子的分类 1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。 2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。分α、β和g三种类型。 3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。 4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。 6生长因子(growth factor，GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。 四、 HYPERLINK 细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染 2.调节T、B细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫 3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞 4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用 5.在超敏反应和自身免疫病中的作用 6.细胞因子通过激活其相应受体（CKR），导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。 五、 四种蛋白表达体系比较 表达 细胞 优点 缺点 原核 E. coli 繁殖快、成本低、产量高 遗传背景及基因表达调控机制清楚 易于大规模培养，成本低廉 蛋白常为包涵体，纯化困难 无糖基化（分泌蛋白，细胞膜上蛋白不可用），生物活性不定 无翻译后修饰，内毒素含量高 酵母 Pichia 使用简单，表达量高，His-tag便于纯化，一定的翻译后加工可进行糖基化修饰，操作简单，适合大规模生产 可诱导表达，也可分泌表达，产物便于纯化 有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求 昆虫 High-5 产量高 ，翻译后加工与哺乳动物相似 对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势 无内毒素污染 蛋白活性不如哺乳动物 适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白 哺乳 CHO HEK293 完善的翻译后加工，活性接近天然蛋白 周期长、技术要求高 表达产量低 ? 六、 生物学活性质控 不同的细胞因子用不同的方法进行相应的体外（in vitro）或体内（in vivo）活性检测。 重组细胞因子活性通常会以ED50（半数有效浓度）或units（活性单位）来标识。因此1mg细胞因子中所含的活性单位（units）可以理解为将1mg/ml细胞因子原液稀释成ED50的稀释倍数 注：ED50 (半数有效浓度): 可诱导50%最大反应的细胞因子浓度 1) ED50=1.0ng/ml, 则1.0 ng/ml相当于1 unit; 2) 1mg PDGF-BB中含有多少个units呢? Units=1mg/1.0 ng/ml=106 3)若测定的ED50为0.5ng/ml对应比活性为： 1mg/0.5ng/mg=2X106 ? 七、纯度测定 纯度：由以下方法测定纯度大于95.0%（a）高效液相色谱（SEC-HPLC）；（b）还原和非还原银染SDS。 ??SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构 ??强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫