DNA提取方法简介2006.7.13课件.pptVIP

植物DNA提取;植物DNA提取方法简介;核DNA分子呈不对称的线状结构。高等植物核DNA的分子量为1012左右，长度约109bp。在分离纯化过程中，DNA分子的降解是很难避免的，因而分离纯化所得到的只不过是植物核DNA分子的片段。用于Southern杂交的植物DNA样品在长度上应不小于50Kb。 线粒体DNA和叶绿体DNA分子要小得多，分子量约为107，且为环状结构。;植物总DNA的提取是在破碎细胞时加入去污剂等试剂使核蛋白体解析，然后或是使蛋白质变性沉淀，抽提DNA，或是使DNA沉淀进入固相而与液相中的蛋白质、多糖等杂质分离。RNA的去除主要采用RNase消化，最后用乙醇或异丙醇沉淀DNA。;二、植物总DNA提取传统方法概述;CTAB法原理：;（1）2×CTAB提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%（W/V）CTAB，40mmol/L巯基乙醇。 （2）10% CTAB：10%CTAB，0.7mol/L NaCl。 （3）氯仿：异戊醇＝24：1 注：CTAB有毒。;SDS法原理：; （1）提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0），50mmol/L EDTA（pH8.0）， 0.5mol/L NaCl，10mmol/L巯基乙醇。 （2）10%或20%SDS。 （3）5mol/L KAc。 ;提取植物总DNA的流程：;⑷ 将上清液转入另一离心管中，向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置37℃20-30min。加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下，12000rpm离心10分钟。（可以重复2~3次） ⑸ 将上清转入另一离心管中，加入1倍体积的异丙醇或2倍体积的95%乙醇，混匀，室温下放置30分钟，观察沉淀生成。 ⑹ 8000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用70%乙醇洗涤，吹干，溶于TE或去离子水中备用。;用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm下 的读数。 样品浓度（μg/mL）= OD260×稀释倍数×50 对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈ 1.8，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280 1.8 说明有RNA污染；OD260/OD2801.8说明有蛋白污染。 ;注意事项;三、DNA提取过程中的注意事项;注意事项;CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液离心和其它操作时不能在低温下进行。 转移DNA溶液用的枪头要剪去尖部，以避免对DNA的机械损伤。 所得DNA沉淀应为白色或灰白色，若呈褐色则有多酚物质污染。 吹干沉淀时，不能吹得太干，太干会使DNA断裂，也可不采用真空抽干，将离心管置于通风柜或超净工作台中令乙醇自然蒸干。;Thank you