应用Bac-o-Bac双启动子表达系统在家蚕中表达BmCecB2.pdfVIP

摘 要 家蚕抗菌肽Cecropin B是家蚕免疫系统产生的一种具有生物活性的小分 子多肽，无分子内的二硫键，分子质量约为4kDa ，其N 端和C端分别具有强碱 性和强疏水性。抗菌肽Cecropin B具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用，此外 抗菌肽还可作为绿色健康的饲料添加剂应用在畜牧生产中，促进动物健康生 长，提高动物自身免疫力，因此抗菌肽的研究已成为生命科学领域的一大热 点。抗菌肽从生物组织中分离获得大量的抗菌肽难度大，成本高，以融合蛋 白的形式表达，表达产物活性较低，纯化过程比较复杂，并且翻译后加工修 饰不完善，而采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统所产生的重组病毒多数情况下 通过皮下注射的方式接种昆虫，效率低下，因此通过构建可同时表达polh 基 因和外源目的基因的真核表达系统进行抗菌肽基因工程的研究已成为一个热 门话题。 本研究应用Bac-to-Bac 表达系统，构建含有家蚕抗菌肽cecropin B2 基因 与polh 基因的双启动子载体，在家蚕中表达，获得具有抑菌活性的 Cecropin B 抗菌肽，并进行表达量分析，研究结果如下： 1.获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh 分别以质粒 PET-32a-BmCecB2 和野生型 T3 株基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，合成BmCecB2 基因和polh 基因，再将两个基因克隆到pFastBacDual 转 移 载 体 Pp10 和 Pph 的 MCS 的 下 游 ， 构 建 重 组 质 粒 pFastBacDual-CecB2/polh ，再转化到DH10Bac E.coli 感受态细胞，发生转座， 获得重组Bacmid-CecB2/polh ，Bacmid DNA 通过转染 BmN 细胞获得重组杆 状病毒BmNPV-CecB2/polh 。 2 . 目的基因在家蚕幼虫中表达及鉴定 重组Bacmid-CecB2/polh 通过脂质体介导转染BmN 细胞，转染72h 后， BmN 细胞有明显的感染症状，在显微镜下可见细胞呈现圆球形，并能观察到 大量的多角体。重组病毒液经口添食家蚕幼虫，144h 后，添食重组病毒的家 蚕有明显感染症状，蚕血呈乳白色，收集受感染家蚕的血液，超声裂解细胞， Tricine-SDS结果表明家蚕抗菌肽cecropin B 基因与polh 基因在家蚕体 中均得到表达，家蚕抗菌肽cecropin B 基因大小约为 4.9KD ，polh 基因大小 约为 29KD 。抑菌试验的结果显示表达的家蚕抗菌肽Cecropin B 具有抑菌活 性，抑菌直径为 10mm 。ELISA 表达量检测结果得知蚕体粗提物中BmCecB2 平均浓度 0.115μg/mL ，蚕血BmCecB2 平均浓度为 0.109μg/mL ，为今后进一 I 步的实验研究提供依据。 通过以上研究结果表明，构建双启动子表达载体同时表达家蚕抗菌肽 cecropin B 基因及polh 基因，由此获得的重组病毒既可以在家蚕培养细胞内 表达，也可以利用多角体经口添食感染家蚕幼虫实现高效率表达，为大规模 生产及畜牧业应用提供理论基础。 关键词：抗菌肽 Cecropin B ，多角体蛋白，pFastBacDual ，Bac-to-Bac 表达系 统，抗菌活性 II Abstract Antimicrobial peptides Cecropin B is a kind of small molecular weight protein produced by immune organisms of silkworm, molecular mass of about 4kDa , it cannot form intramolecular dis