第二章基因工程主要技术原理-西北师范大学.pptVIP

第三节 PCR技术原理 2.3.1 核酸体外扩增最早的设想 2.3.2 聚合酶链反应的发明 PCR传奇 2.3.3 PCR 原理 2.3.4 PCR反应过程 2.3.5 PCR反应体系 引物与退火温度： 模 板 2.3.6 PCR的相关技术 逆转录PCR (retrotranscription PCR, RT PCR) 锚定PCR (anchored PCR) 反向PCR (inverse PCR,inPCR) 2.3.7 PCR技术的应用 2.3.9 PCR技术未来发展的方向 回答问题 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 第二章 基因工程基本技术原理—PCR 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 PCR （polymerase chain reaction）是指模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA某个特殊区域的技术.? PCR是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学、基因工程和其它与DNA鉴定相关领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。 返回第二章 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。 但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 其原理类似于DNA的体内 复制。 开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶。 耐热DNA聚合酶的应用使PCR反应更易于自动化。 PE-Cetus公司推 出的第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 PCR具有划时代意义，Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔化学奖 《自然》周刊 1976年的《细菌学杂志》（Journal of Bacteriology）：台湾 钱嘉韵 （Alice Chang）文献耐热DNA聚合酶 《科学》周刊 先后拒发表 《酶学方法》（Methods of Enzymology）：吴瑞 1983年春天的一个周五晚上， Mullis开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。 PE-Cetus公司与Mullis Cetus70年代以制造维生素及抗生素为主开始转型，进入80年代以基因产品为主的研发：生长激素、胰岛素、凝血因子、干扰素、白介素等 基本原理：即DNA合成的基本原理 基本要素：teplate/primer/DNA polmerase Template:ssDNA or dsDNA Primers:oligo-nucleotides等 Substrates:dNTP DNA polymerase: Taq polymerase? 5’ amplicon 3’ 3’ 5’ 94℃ 37℃ 72℃ Cycle 1 2分子 Cycle 2 4 分子 Cycle 3 8分子 ①变性:将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA； ②退火:将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对； ③延伸:将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。 如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。 一般需使用一对引物 新合成的链又可作为模板 94℃4min 94℃1min 4℃+∞ 72℃ 10min 72℃1min 65℃1min 变性 退火 延伸 30循环 缓冲液 buffer（1×）： 50 mM KCl 引物退火 10 mM Tris.HCl pH 8.3-9.0 1.5 mM MgCl2 (0.5-2.5) dNTP： 终浓度0.2mM(即饱和浓度)（pH7.0） 4种dNTP应平衡，提高忠实性 使用时应考虑Mg2+，引物，产量之间的关系 如序列分析和制备探针时，用20-40mm? 引物： 各1mm，即1pmol/ml OD260=1时: dsDNA 50mg/ml（molecular cloning） ssDNA 40mg/ml oligo 3