邻苯二酚类化合物的合成及作为核酸交联剂的生物活性研究——武汉大学综合化学实验实验报告.docxVIP

邻苯二酚类化合物的合成及作为核酸交联剂的生物活性研究（武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072）摘要：本实验合成了两个邻苯二酚类化合物，分别检测它们对不同二级结构核酸的交联活性。实验的活性检测部分既包含对双链核酸的交联活性检测，又包含对G-四链体的交联活性检测，分别通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳监测其交联活性。最后用圆二色谱测G-四链体的半解链温度，并用MBTH显色反应证实邻苯二醌中间体的产生，进一步证实了交联的发生。关键词：邻苯二酚类核酸交联剂G-四链体中图分类号：O 643 文献标识码：A0 引言交联具有重要的生物学意义。组成 DNA 长链的碱基，糖环和磷酸基团中含有大量的富电子的 N， P 原子，O，这些原子容易受到亲电试剂的进攻。利用这一点，在特定的药物小分子上接上亲电基团，这些亲电基团进攻富含电子的 N，O，P原子从而生成稳定的共价键。从而改变了 DNA 的结构组成，达到阻碍 DNA 复制和转录的目的。这样的过程被称为 DNA 的烷基化。而这些小分子就被称为 DNA 的烷基化试剂。有很多研究表明，在生物体中的 DNA 的被烷基化后，生物体会有一个自生修复的机制。被烷基化的 DNA 可以通过生物体内的 DNA 修复酶得到部分修复。使得这样的 DNA 损伤不至于影响到生物体内遗传信息的传递和细胞的死亡。但是如果药物分子带的烷基化基团增多，对 DNA 双链烷基化效果更好，也就使 DNA修复酶对 DNA 的修复作用变弱。通常我们把这些带有两个或者以上的烷基化试剂叫做 DNA 的交联剂。EcoR I是Ⅱ型限制性内切酶[1]，EcoR I以同型二聚体作用，两个EcoR I分子沿着DNA识别序列的相对方向排列，进入DNA分子内部对碱基发挥作用。EcoR I分子内部特异性氨基酸与DNA识别序列GAATTC形成氢键。一旦结合，限制酶内部的其他残基催化水解反应，利用水破坏识别序列内部DNA双链中每条链的磷酸二酯键[2]。本实验将其用作对pBR322质粒DNA进行酶切，得到线性的DNA分子有利于通过凝胶电泳研究化合物的交联模式。邻苯二酚是苯的两个邻位氢被羟基取代后形成的化合物。在氧化剂氧化条件下生成邻苯二醌活性中间体，它可以与碱基发生化学反应，即烷基化作用，两个位点的烷基化作用也就形成所谓的核酸交联。本实验将合成两个邻苯二酚类化合物，以酪氨酸酶为氧化剂分别检测它们对不同二级结构核酸的交联活性。G-四链体，是由4个鸟嘌呤作为基础发生交互作用结合成为一个正方形，它们是一种暂时性结构，大量存在于即将分裂的细胞之中，它们出现在染色体核和染色体终端(可以保护染色体免受损害)。由于癌细胞分裂非常迅速，在染色体终端经常出现缺陷，四重螺旋体DNA分子可能唯一存在于癌细胞。酪氨酸酶被称为多酚氧化酶，被指出和某些疾病以及肿瘤有关。酪氨酸酶在恶性肿瘤黑素瘤细胞中高表达。酪氨酸酶能氧化诱导邻苯二酚类化合物得到高活性的邻苯二醌中间体，从而与DNA进行交联。本实验设计的化合物主要针对核酸G-四链体，拟实现对这种特殊核酸二级结构的选择性交联，并通过酪氨酸酶的酶诱导，实现对癌细胞的特异性作用，以减小药物的毒副作用。因此实验的活性检测部分既包含对双链核酸的交联活性检测，又包含对G-四链体的交联活性检测，其中对双链的检测是验证化合物靶向特异性的反面证明。1 实验部分1.1试剂与仪器1.1.1试剂邻苯二胺（A.R），对苯二胺(A.R)，3，4-二羟基苯甲醛，3M pH 5.2 NaOAc，乙醇，DMSO，琼脂糖，去离子甲酰胺，MBTH， Tris-HCl（100 mM pH 7.0），10×碱性电泳液（500 mM NaOH，10mM EDTA），中和溶液(1 M Tris pH = 7.6 和1.5 M NaCl溶液) ，6×Lording Buffer（300 mM NaOH，6 mM EDTA，18 % m/V Ficoll-400，0.15 %溴甲酚绿，0.25 %二甲苯氰），Gel Red 染色剂（10000×，使用是用0.1 M NaCl稀释），40 mL，20 %变性聚丙烯酰胺凝胶：40 % ，19：1丙烯酰胺20mL，5×TBE缓冲液（54 g Tris碱，27.2g硼酸，20 mL 0.5mol/L EDTA）8 mL，尿素16.8 g，10 %过硫酸铵360 μL，TEMED 40 μL。[3]pBR322质粒DNA，Lambda Hind III marker，EcoR I限制性内切酶，酪氨酸酶，荧光标记的Pu27 序列。1.1.2仪器三口烧瓶，圆底烧瓶，回流冷凝管，漏斗，锥瓶，移液枪，1.5mL EP管，0.5mL EP管，试剂盒加热磁力搅拌器，PHS—3C型精密pH计，电热恒温水浴箱，台式离心机。微型混合器琼脂糖水平电泳槽，