DNALADDER检测细胞凋亡的讨论.docVIP

DNA LADDER检测细胞凋亡的讨论 例一 gongyulai ：我用的是药物诱导癌细胞凋亡，做DNA Ladder（用的是北京鼎国的动物细胞凋亡梯子提取试剂盒）。跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象，Marker到是出来了。我是按说明书上0。8%的琼脂糖。我用的是60v电压。不知道什么原因？郁闷。说明书上说混合温和是什么意思，我又没用力摇。我还想问收集凋亡细胞时离心时转速多少比较好？ chujun_hust ：（1）“跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象”： 可能是由于你点样时，时间太长了，导致样品扩散；还有一个原因是你设置的电压太高，最好是2~4v/cm，跑4～6小时比较合适（2）“我是按说明书上0。8%的琼脂糖”：凝胶浓度太低了，把凝胶浓度加大到2％，放心做，没问题的（3）“说明书上说混合温和”：那是怕你混匀太剧烈导致细胞基因组DNA断裂啊，注意很轻轻的混匀（4）“收集凋亡细胞时离心时转速”：我在实验室中是5000rpm，离心5min，我觉得足已 mmyycc ：我的ladder总是只有一条带，与对照组差别不大，用的是100v,1-1.5h,不知道是不是这个原因？溴酚兰跑到什么位置合适呢？ chujun_hust ：电压设置太高了啊，溴酚兰一般跑到蓝色离胶顶2cm左右吧。附上我刚刚做的DNA LADDER图象，我用的不是试剂盒，是按照《细胞实验指南》上做的，效果不错啊具体见：/bbs/post/view?bid=66id=495351sty=1tpg=1ppg=2age=0#518411 lwk2003 ：请问做DNA LADDER时选择处理后细胞多长时间就可以提取细胞DNA比较合适？我看有的文献是处理细胞3天后提取DNA的，是不是时间太长了？ gongyulai ：我觉的根据不同情况吧。如果我是同一浓度不同时间测和不同浓度同一时间应该不一样的。 chujun_hust ：我觉得对于不同药物/不同剂量/不同细胞系,不同接种密度,细胞发生DNA LADDER的时间都不一样,所以最好是每隔12小时,或者24小时测量一次,我是每隔8h做的,连续奋战了3天3夜啊!然后根据跑电泳的结果决定什么剂量/什么时间,DNA LADDER效果最好! 例二 brainchip ：我现在正在建立凋亡细胞的凝胶电泳检测方法，可是几次实验的结果都不是很理想，我所以参考的方法是卢圣栋编著的分子生物学实验技术一书中记载的方法，但是结果不是根本检测不到]就是荧光太弱，看不太清。附加的是我用数码相机拍摄的最近一次电泳的照相结果。第二道好象有凋亡的ladder，如何才能使每次的荧光强度增高呢？我试过了增加EB的量和浓缩样品，加大上样体积都收效不大，是不是在样品处理收获DNA时应该注意些什么呢？第二道究竟是不是凋亡的LADDER呢？这种图象是不是可以达到发表要求呢？ wscoco78 ：我感觉你的样品凋亡率不是很高，我参照的是黄培堂编译的那本细胞实验指南（冷泉港），和各种形形色色的方法比，最大特点就是不用酚氯仿抽提，而是Rnase和蛋白酶K消化后，直接点样电泳，这样做效果不错，你可以试试，再就是低电压。我以前试的那些方法我是没有做出来的！国内的书大概只是用来看的吧。 celia_xl ：想请教楼上，我也曾按照您所说的方法做过，但是加样时太粘稠了，怎么也加不进，还请从您的经验指导一下，有关用这个方法做凋亡所需要注意的地方。 wscoco78 ：呵呵，你看来也是那本书的读者，但是你应该注意到那本书所讲的，加样应在干孔中加，就是电泳槽没有上缓冲液之前加样，其实那本书所提示的每一小点都有它的作用，注意事项我不敢谈，好像也没什么特别的，如果对样品的凋亡程度信心不足的话，冷冻抽真空浓缩一下可能效果更好，不谢，希望你能顺利解决战斗，也希望破除DNA ladder难做的迷信，毕竟我也被这个东西折磨了老大一段时间，以为那些经典方法才是最好，其实抽来提去的，fragment早都丢完了，鄙视那些经典。 chujun_hust ：唉，我也为该选哪种方法而苦恼啊！但现在一个问题是SDS加入溶液后，溶液变浑浊，始终不能溶解，不知道是怎么回事啊？ wscoco78 ：你是加固体吗？！配成10％的SDS(pH8.0)，临用前加入裂解液(pH8.0)(final concentration 0.2-0.8%). songkui2001 ：我也用此种方法做过了,其实这种方法的效果还是比所谓苯酚抽提法好一些又省力省东西. chujun_hust ：（to wscoco78）我是直接加的SDS粉末的，具体配制过程如下：我是按照cell(1996)上一篇paper上配方NaCl:0.2M, EDTA:5mM, Tris-Cl:100mM(pH=