ELISA技术的质量控制.docVIP

ELISA技术的质量控制 标签： ELISA? 分类： 临床工作 2007-07-25 15:15 ELISA简介：酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA）于1971年分别由瑞典学者和荷兰学者报道，开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面，测定时，将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，在酶的催化下变为有色物质，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中被测物质量。 此方法具有高度的敏感性和特异性，酶标试剂比较稳定，且易于自动化，因此应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可使用，我室开展的肝炎病原学检测、HIV抗体检测、梅毒抗体检测等都使用ELISA方法。 ELISA质量保证是一个复杂的过程，许多重要的环节都影响到检测的质量。一、方法学的影响ELISA测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法（HBeAb,HBcAb等采用）因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。二、试剂因素不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，避免反复冻融造成试剂的失效。试剂使用前必须平衡至室温，否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需使用的试剂应密封并及时放回冰箱保存。三、样本因素标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶等，后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素，而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒。在临床中遇到少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。以下对外源性干扰因素进行简要说明：1.标本溶血 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其具有类过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）为标记酶的ELISA测定中，如果血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应显色。2.标本被细菌污染 标本的采集及血清分离要注意尽量避免细菌污染。细菌菌体中除可能含有内源酶对测定产生非特异性干扰外，还可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用。另外标本在保存中出现浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。3.标本贮存时间过长 标本在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底加深、甚至出现假阳性结果。通常情况下血清标本可在2～8下保存l周，冷冻保存时间会更长，但对于抗体或抗原含量低的标本而言，则可能会因抗体掉价、抗原分解而出现假阴性结果。4.标本凝固不全 血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。5.冷冻保存标本避免反复冻融 标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可。四、操作因素对ELISA结果的影响ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。1.加样加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不准，尤其是对于样本量较大的临床实验室，因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本时均需更换吸嘴，以免发生交叉污染。加样时速度不可太快，避免将标本加在孔壁上部 ，并注意不要溅出或产生气泡，产生气泡可以减少标本与包被物的接触，降低试剂的敏感性。不要让吸头接触孔底部，以防破坏包被物，吸附血清内的蛋白，造成假阳性。加样时还应当注意操作