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T-DNA插入侧翼序列的分离方法 获得T-DNA插入突变体库后，插入突变体在基因序列水平上的变化与表型变化的关系，必须通过序列分析来做进一步的研究。通过对T-DNA插入位点侧翼序列的生物信息学分析，可以预测整合位点的基因功能，获知该基因控制的表型信息。目前，用于分离T-DNA插入侧翼序列的方法主要有：热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR）技术（Liu和Whittier，1995）、反向PCR（Inverse PCR，IPCR）技术（Triglia等，1988；Dose等，1991）、接头PCR（Adaptor Ligation PCR）技术（Rosenthal和Jones，1990）、质粒拯救（Plasmid rescue）技术（Perucho等，1980；Grant等，1990）和PCR步移（PCR-Walking）技术（Siebert等，1995）等。 1 TAIL-PCR TAIL-PCR技术起初被用来分离P1和YAC克隆插入末端序列（Liu和Whittier，1995），经过改进后用于分离拟南芥T–DNA插入侧翼序列（Liu等，1995）。其基本原理是利用多个嵌套的插入序列特异性引物（Special Primer，SP）分别和较短的、Tm值较低的任意简并引物（Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer）组合，特异引物的Tm值一般在57-62℃，AD引物的Tm值一般在44-46℃，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应使特异产物的扩增优先于非特异性产物的扩增，从而得到特异性的扩增产物。TAIL-PCR的反应流程如图3所示，一般分为3次反应：第一次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性的反应和12次热不对称的的超级循环构成。通过5个循环高特异性的反应，使SP1与已知的序列（载体或T-DNA）退火并延伸，提高目标序列的浓度。1次低特异性的反应使AD引物结合到较多的目标序列上，10个循环较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火，随后进行12个热不对称超级循环（每个超级循环包括2个高特异性反应和1个较低特异性反应）。经过上述反应可以得到不同浓度的三种类型的产物：特异性产物（I型）和非特异性产物（II型和III型）。第二次反应则将第一次反应的产物稀释1,000倍作为模板，以SP2和同一AD引物作为引物进行10个热不对称超级循环，使特异性产物被选择性的扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第三次反应又将第二次反应产物稀释1,000倍作为模板，以SP2和同一AD引物作为引物进行普通的PCR扩增。通过上述三次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 与其他侧翼序列分离方法相比，TAIL-PCR具有操作简单、对DNA样品要求不高、特异性高、扩增效率高、快速、灵敏度高等优点，并且PCR产物可以直接用来测序（Liu和Whittier，1995）。为了进一步提高TAIL-PCR扩增效率，McElver等（2001）简化TAIL-PCR的扩增步骤，并把扩增条件加以改进。Sessions等（2002）通过建立简并引物池的方法，大大提高了TAIL-PCR扩增的效率。目前，TAIL-PCR已经被广泛地用于各类插入突变体库侧翼序列的分离，如拟南芥T-DNA插入突变体库SALK（Sessions等，2002），日本国立农业研究院水稻Tos17插入突变体库（Miyao等，2003），本室水稻T-DNA插入突变体库RMD（Zhang等，2006）以及台湾水稻T-DNA插入突变体库TRIM（Hsing等，2007）等，都是采用TAIL-PCR技术分离的侧翼序列。 2 反向PCR 反向PCR 技术分离侧翼序列的基本原理是：首先用限制性内切酶消化带有T-DNA或转座子插入的基因组DNA，对所选用限制性内切酶要求切除的产物中，含有在已知T-DNA或转座子上有一个酶切位点，另一个酶切位点在未知的基因组中的片段；将酶消化后的DNA片段连接，使其环化；利用T-DNA或转座子的边界已知序列设计一对反向引物进行PCR扩增，即可获得插入位点两侧未知的基因组序列（反向PCR的反应流程如图4所示）。最初的反向PCR技术是用来快速扩增任何一个已知基因片段两侧未知序列。它避免了对未知序列的克隆、亚克隆和文库筛选等繁琐步骤。选择合适的核酸内切酶是反向PCR技术成功的关键之一：酶切产生的片段不要太大，酶切位点距边界最好在3－5kb，便于环化；酶切效率要高，产生粘性末段，可以提高连接的效率；大规模分离序列时选用常用酶，可以大大降低分离的成本。反向PCR也存在一些缺陷：由于涉及到酶消化和连接，对基因组DNA的要求相对P