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三种寡核苷酸纯化方法比较摘要：分别采用固相萃取法、电泳法、色谱法纯化寡核苷酸，色谱分析结果表明产物纯度高，固相萃取法纯化后的产物纯度低于电泳法与色谱法，但产量相对较大，ＰＣＲ检测结果证明３种方法纯化的寡核苷酸具有良好的检测性能。在建立的固相萃取纯化试验条件下，对３种填料纯化寡核苷酸的效果、产量、成本进行了比较分析，结果表明，使用硅胶Ｃ１８和聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）填充的萃取小柱既能达到良好的纯化效果又可降低成本。 关键词：寡核苷酸；纯化；固相萃取；电泳；色谱 中图分类号：ＴＱ４６４．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）14－3065-05 Comparison of Three Purification Methods for Oligonucleotides ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ (Textile and Chemical Engineering College, Binzhou Polytechnic, Binzhou 256603, Shandong, China) Ａｂsｔｒａｃｔ： Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｂｉｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＰＣＲ ｔｅｓｔ， ａｌｌ ｔｈｅ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ， ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｏｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｉｌｌｅｒｓ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｏｏｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ with ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｃ１８ ａｎｄ ＰＳ／ＤＶＢ ｆｉｌｌｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ｐｕｒｉｆｙ； ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 寡核苷酸是由核苷酸通过３′，５′－磷酸二酯键连接而成的短链ＤＮＡ分子。它可作为ＰＣＲ检测所需要的引物或探针的主要组成部分，广泛应用于生物学、农牧业、医学等领域［１－３］。目前，中国已可使用ＤＮＡ合成仪快速合成各种序列的寡核苷酸以及荧光标记的寡核苷酸，最常用的寡核苷酸为１０～３０ ｎｔ。以链长为２５ ｎｔ的寡核苷酸为例，产物纯度约为８０％～８５％，其中含有一定量的杂质，如５′羟基不完全脱二甲氧基三苯甲烷（ＤＭＴ）保护基团或不完全封闭羟基产生的非目标序列等。这些杂质不但造成寡核苷酸定量不准，还可能影响到下一步的生物学试验。因此，合成后的寡核苷酸需要纯化。目前大多采用的寡核苷酸纯化方法有３种，分别为固相萃取法［４］、电泳法和色谱法。 研究采用美国应用生物系统公司的ＤＮＡ合成仪合成寡核苷酸，分别采用３种方法在优化的试验条件下进行纯化，比较纯化效果；再应用制备的寡核苷酸作为ＰＣＲ检测用引物，成功地从南瓜果实中检测到了黄瓜绿斑驳花叶病毒［５］；另外，对固相萃取法和色谱法纯化寡核苷酸进行了具体的研究。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 原料 聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）（粒度５０ μｍ）、ＹＭＣ*ＧＥＬ ＯＤＳ－Ａ制备色谱球形填料／硅胶Ｃ１８（平均孔径１２ ｎｍ，粒度５０ μｍ）购自北京慧德易科技有限责任公司，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱（货号ＷＡＴ０９４２２６）、ＸＴｅｒｒａＴＭ ＭＳ Ｃ１８柱（５０.0 ｍｍ×４．６ ｍｍ，平均孔径１４ ｎｍ，粒度２．５ μｍ）购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司，筛板、６ ｍＬ萃取柱购自大连思谱精工