人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用分析.docVIP

　　人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用分析 --人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用分析 [摘要]　目的:观察Smad7反义寡核苷酸对转化生长因子β1(transforming groad7反义寡核苷酸促进TGF-β1对人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用。结论:Smad7参与介导TGF-β1对人牙髓细胞增殖和ALP活性的调控,提示TGF-β1调控人牙髓细胞生长和分化可能是通过Smad信号途径发生的。 [关键词]　Smad7 牙髓细胞 细胞增殖 碱性磷酸酶 [Abstract]Objective:To investigate the effect of Smad7 antisense oligonucleotide (ODN) on groan dental pulp cells regulated by transforming groetric assay and assay of alkaline phosphatase (ALP) activity ad7 antisense ODN pro-mote the proliferation and ALP activity of human dental pulp cells mediated by TGF-β1.Conclusion:Smad7 mediate theproliferation and ALP activity of human dental pulp cells regulated by TGF-β1. TGF-β1 may regulate the groan dental pulp cells through Smad signaling. [Key ad7; human pulp cells;proliferation;alkaline phosphatas 已有研究证实TGF-β1调控牙髓细胞的生长和分化[3-5],但是对于TGF-β1调控牙髓细胞生长和分化的细胞内信号转导途径,目前仍不清楚。Smad7为TGF-β细胞内信号转导的拮抗分子,它通过与TGF-β细胞内信号转导分子Smad2或Smad3竞争结合TGF-βⅠ型受体,抑制Smad2或Smad3被TGF-βⅠ型受体磷酸化,从而特异地抑制TGF-β信号转导过程[6, 7]。本实验的目的是通过转染Smad7反义寡核苷酸至人牙髓细胞,观察对TGF-β1调控人牙髓细胞生长和分化的影响,并探讨其分子机制。 材料和方法 1.主要试剂和仪器　TGF-β1(Promega, USA),MTT(Sigma,USA),胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS), DMEM(Gibco, USA),DG-1型酶联检测仪(华东电子管厂)。 2.细胞培养　取因阻生或正畸需要拔除的健康牙齿(患者年龄10-25岁),拔除后立即置入含有培养液的青霉素瓶中,在超净工作台内用DMEM培养液彻底冲洗牙齿,然后劈开,取出牙髓组织,去除根尖1/3部分的牙髓,在DMEM培养液的浸润下,将牙髓组织剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块,均匀铺于灭菌的25 ml培养瓶底,将瓶底向上加入含20%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液,二氧化碳培养箱37℃培养。2 h后将瓶底翻转向下,继续培养,每3~4d换液1次,待细胞从组织中游出,取第4~6代细胞进行实验。 3. ODN合成及序列反义Smad7 ODN及正义Smad7 ODN由上海生工生物工程有限公司合成.ODN的5’端和3’端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义ODN序列与靶序列一致。反义ODN序列与靶序列互补。反义Smad7寡核苷酸序列:5’-GTTTGGTCCTGAACAT-3’;正义Smad7寡核苷酸序列:5’-ATGTTCAGGACCAAAC-3。 4.实验分组　实验分为3组,对照组、转染正义Smad7ODN组和转染反义Smad7 ODN组。每组又分为TGF-β1刺激组和不加TGF-β1刺激组。 5. MTT法检测细胞增殖　人牙髓细胞以3×104/ml接种至96孔板,每孔加100μl培养液,每组4个孔。细胞在含10%FBS的DMEM培养液中培养24 h后,进行细胞转染。细胞转染参照LipofectAMINE 2000(LF2000)说明书进行。主要步骤如下:将1μg正义或反义ODN稀释至50μl无血清的Opti-MEMⅠ培养基(Gibco,BRL)中,室温孵育15 min;同时稀释2μl LF2000至50μl无血清培养液Opti-MEMⅠ培养基中,室温孵育5 min;将稀释的DNA和稀释的LF2000混合,室温孵育20 min,使DNA-LF2000复合物形成;将DNA-LF2000复合物100μl加至每孔待