外源性DNA残留量测定法(药典).docVIP

附录Ⅸ B外源性DNA残留量测定法 第一法 DNA探针杂交法 供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。 试剂（1）DNA标记和检测试剂盒 （2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。 （3）2%蛋白酶K溶液 称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。 （4）3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。 （5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用盐酸调pH值至8.0。 （6）5.0mol/L氯化钠溶液 （7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） 用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH至8.0。 （8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液 用盐酸调pH至7.2。 （9）蛋白酶缓冲液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液 2.5 ml， 加灭菌水至10ml。 （10）TE缓冲液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。 （11）1%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度， 摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。 （12）DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。 用于探针标记和阳性对照的DNA制备 用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。 将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml含107个细胞，如果为细菌，则将其浓度调整为每1ml含108个细胞细菌。取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400μl混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和酚溶液450μl，剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450μl重复抽提一次；转移上层液体，加入三氯甲烷450μl，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入pH 5.2的3mol/L醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加入-20℃以下的无水乙醇1ml，充分混合，-20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量-20℃70％乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。 用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度：应无RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.8～2.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.2～1.0）。 用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片断大小适合于DNA杂交和探针标记。 阳性对照品的DNA浓度根据下式计算 DNA浓度（ng/μl）= 50×A260 阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20℃以下保存，长期使用。 探针的标记 按试剂盒使用说明书进行。 测定法 （1）蛋白酶 K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混合后37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。 加样量 2％蛋白酶K溶液 蛋白酶缓冲液 3％牛血清白蛋白溶液 加水至终体积 供试品 100μl 1μl 1μl 200μl D1 100μl 1μl 1μl 适量 200μl D2 100μl 1μl 1μl 适量 200μl D3 100μl 1μl 1μl 适量 200μl 阴性 100μl 1μl 1μl 适量 200μl 注意事项：供试品的稀释 根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100μl 含1人份剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白含量较低，可用DNA稀释液将供试品稀释至每100μl 含1/10人份剂量或每100μl含1/100人份