真核生物基因组DNA的提取和含量测定.docVIP

实验报告 课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 指导老师： 同组学生姓名： 廖杰 成绩：__________________ 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。 真核生物基因组DNA的提取 本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。 DNP在0.14mol/L NaCl中不溶解,而RNP可溶解。 用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K和SDS）。 １温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性， ２可以变性Dnase， ３还可以去除部分的蛋白。 ４使核蛋白体从DNA上解离。 　 然后加RNase以去除RNA，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法： 　 酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。 若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。 异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。 变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。 该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。 　 但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。 　 砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase的活性。 收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度 1．紫外分光光度法测定核酸含量： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。 2．紫外分光光度法测定DNA纯度： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。 三，二苯胺显色法测定DNA含量 DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595 nm处有最大吸收。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。 【操作与步骤】 一、 基因组DNA的提取 1．组织细胞的裂解 （1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。 （2）碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。 （3）匀浆液转入2mL离心管，4℃ , 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100μg/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50℃保温90分钟, 直到组织完全解体。 （4）加10mg/ml的RNase 16μl (终浓度200μg/ml)，37℃保温40min。 2．裂解物中蛋白质的去除 （1）加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 于4℃，12000rpm离心15min。离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。 （2）小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，重复上述操作以去除蛋白质，直至界面不再出现明显的变性蛋白质为止。 （3）小心吸出上面的水层并转移到另一新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。4℃，12000rpm离心15min。本步骤可去除微量的酚。 3．DNA的沉淀 　(1)上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。10000rpm离心10min，弃上清。 　 　(2)DNA沉淀溶解于3ml TE 中，进行260nm/280nm紫外检测。 二、 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度 1．用TE缓冲液稀释样品（5～20倍）， 2．用TE缓冲液调