西华基因工程原理与技术复习题.docVIP

基因工程原理与技术 名词解释 （1）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （2）顺式作用元件（cis-acting elements），指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 （3）反式作用因子（trans-acting elements），可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子称为反式作用因子（trans-acting elements）。 （4）锌指（zinc fingers）结构，由约30个氨基酸残基组成的一段多肽序列，其中 4个氨基酸残基（两个是半脱氨酸两个是组氨酸，或4个都是半脱氨酸）以配位键与Zn2+相互结合，形成指状结构，常存在于真核转录因子的DNA结合结构域中。 （5）亮氨酸拉链（leucine zippers），是指在一段肽链中每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸残基，这段肽链所形成的α-螺旋就会出现一个由亮氨酸残基组成的疏水面，而另一面则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条，两个具有亮氨酸拉链条的反式作用因子，能借疏水作用形成二聚体。 （6）反向PCR: 用于扩增位于靶DNA区段之外的两侧的未知DNA序列。 不对称PCR：可用于制备单链模板DNA。这种方法除了使用的两种引物浓度相差100倍之外，其它方面与标准的PCR并没有本质的区别。 多重PCR技术：即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。 . 核酸分离纯化应注意哪些事项？一般的分离纯化分为哪些步骤？各步的要点是什么？ 分离纯化核酸应注意：①应保证核酸一级结构的完整性，防止降解；②排除其它分子的污染。为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。保持核酸的完整性，即保持其天然状态。细胞内的核酸酶活力很高，在制取过程中必须防止核酸酶对核酸的降解。③防止化学因素(酸碱等)和物理因素(高温或机械剪切等)引起核酸变性或破坏。制备RNA要特别注意防止核酸酶的作用，因为RNase分布很广，活力很高；而对DNA更重要的是防止张力剪切作用，因为DNA分子特别长，容易断裂。 核酸的纯化：①首先是去除蛋白质。要点：从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。从核酸溶液中去除蛋白质常用酚/氯仿抽提法，在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。②用氯仿抽提处理，去除核酸溶液中的痕量酚。要点：如果下一步骤中酶反应的条件要求严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68℃水浴中放置10分钟使痕量乙醚蒸发掉。RNA分子量小，集中于细胞质中，易分解。 DNA分子量较大，集中于细胞核中，化学性质稳定。在提取RNA过程中必须放置RNA的降解。而DNA比较“皮实”而且得破核 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与摸板DNA互补的程度 酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，一种是大肠杆菌合成的基因工程酶，催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。 6.PCR反应的基本原理是什么？每个循环包括哪些步骤？有何应用价值？ PCR反应的基本原理：首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段单链DNA来启动（“引导”）新链的合成。 每一个温度循环周期均是由高温