酶联免疫吸附技术(ELISA)的操作要点.docVIP

酶联免疫吸附技术（ELISA）的操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA?检测结果准确可靠的必要条件。ELISA?的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA?各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA?，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。?? 1?标本的采取和保存 可用作?ELISA?测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA?检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA?中血浆和血清可同等应用。 血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP?为标记的ELISA?测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。?2?试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。?ELISA?中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH?计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。?? 3?加样 在?ELISA?中一般有3?次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA?板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法?ELISA?）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1?分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。?? 4?保温 在?ELISA?中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)?，有人称之为孵育，在ELISA?中似不恰当。 ELISA?属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA?反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有?43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELI?SA?方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37经1-2?小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形 成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA?中一般不予采用。保温的方式除有的?ELISA?仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA?板置于水浴箱中，LISA?板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA?板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA?板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25?，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA?板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。?? 5?洗涤 洗涤在?ELISA?过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA?就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干