紫杉烷9α-羟基化酶基因的克隆及功能分析.pdfVIP

NanAcademicMolecularDe—YouDateaDissertationandofofforthe 摘 要 紫杉醇(Tax01)是一种著名的具有多种抗癌疗效的化合物，最早从红豆杉树皮中提 取获得。寻找紫杉醇合成途径中的关键酶基因能为规模化生产紫杉烷类药物奠定理论基 础，紫杉烷90【．羟基化酶就是关键酶中的一个，多年来该基因序列一直没能在红豆杉中找 biloba)悬浮细 到，说明直接从红豆杉中克隆此基因的难度很大。研究发现银杏(Ginkgo A，缩写SIA)进 行90【羟基化，表明银杏细胞含有紫杉烷9伐．羟基化酶的活性，这启示我们如果找到银杏 中紫杉烷9仅．羟基化酶(taxoid 杉烷90【．羟基化酶，从而完善红豆杉紫杉醇生物合成这一重要代谢途径。本研究分析了银 杏细胞转录组高通量测序的数据信息，找到了与CYP450高度同源的紫杉烷羟基化酶候 选基因15个，并克隆了其中的两个基因，分别构建表达载体，进行蛋白表达、酶促反应 以及LC—MS鉴定，成功得到银杏9仅．羟基化酶基因，在此基础上，开展了通过类似手段 从南方红豆杉细胞中寻找紫杉烷90【．羟基化酶基因的尝试。主要研究内容和研究结果如 下： 较高的RNA； 于CYP725家族，全长1775 1899 bp，编码486个氨基酸； System， 白具有紫杉烷9仅．羟基化酶的活性，且产物保留时间是31．86min，该产物的保留时间和 质谱与SIA9a羟基化产物标准品的保留时间和质谱完全一致； 红豆杉细胞基因，随后成功克隆出其中的7个基因，并针对性地进行了4个基因的CFS 表达和LC．MS分析。 关键词：酵母表达，无细胞表达，银杏细胞，紫杉烷90【．羟基化酶 Abstract Taxolisawellknown which has anticancerfunctionsanditsinitial compound multiple extractionwasfromthebarkof forthe inthetaxol yew．Lookingkeyenzymegenes can toset biosyntheticpathwayhelp theoreticalfoundationforfuture of large—scaleproduction taxoidsanticaner isoneofthe butithasn’tbeen agents．Taxoid9a—hydroxylase enzymes successfulcloned indicatesthatit’S difficulttoclonethis from yet．This very genedirectlyTaxus cells．Someresearchfound biloba cellsCan Ginkgo suspension specifichydroxylate 2a，5a，1 itsC9 shows 013，1413一tetraacetoxy一4(20)，11-taxadiene(sinenxanA，SIA)atposition．This bilobace