耐异烟肼结核杆菌快速诊断抗原的筛选及鉴定.pdfVIP

分嚣弓…一——…- 、 密 ； ， 1 绒一～一…一 UDC—————』—上， 编 号 ’ ／ 一～～一 後旦大擎 博士后研究工作报告 耐异烟肼结杆菌快速诊断抗原的筛选和鉴定 姜昕 工作完成日期2QQ垒生窆旦：2QQ鱼笙鱼目 报告提交日期 2QQ鱼生鱼旦 复旦大学(上海) 2005年6月 耐异烟肼结核杆菌快速诊断抗原的筛选和鉴定 摘要 结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病。自20世纪80年代以来，结核病 的疫情有重新上升的趋势，特别是耐药和耐多药菌株的不断出现和传播，使结核 病成为当前世界性的严重公共卫生问题，并引起国际社会的极大关注。由于目前 对耐药结核病没有特效药物，因此对耐药结核杆菌的早期诊断和早期治疗成为控 制耐药结核病的唯一方法。本研究针对目前临床渗断的迫切需要，从耐异烟肼结 核杆菌的表现型入手，利用蛋白质组学的技术手段，寻找耐药结核杆菌与敏感株 问差异表达的蛋白质，通过对其抗原性、敏感性和特异性进行评估，以期筛选出 耐异烟肼结核杆菌快速诊断的抗原。众所周知在结核杆菌的诊断中一个最大的缺 陷就是慢，如何做到快速诊断一直是科研人员努力的方向，本研究在这方面进行 了有益的尝试，研究成果也将具有非常好的应用前景。 为了最终实现对耐多药结核杆菌的快速诊断，有必要先从单耐菌株入手，异 烟肼是重要的一线治疗药物，其耐药机理较利福平耐药复杂得多，仅靠现有的分 子生物学诊断耐异烟肼菌株有一定困难，因此本研究选定单耐异烟肼结核杆菌为 研究对象，探讨用蛋白质组学的方法寻找诊断抗原。本研究中选择9株单耐异烟 肼结核杆菌和7株敏感株，通过比较蛋白质组学手段，发现两者的双向电泳图至 少存在20多个差异表达的蛋白质点，已经用MALDI．TOF鉴定的蛋白质点有6 直以来人们对膜蛋白都十分关注，这是因为这些蛋白通常在细胞生命活动中起着 十分重要的功能，并且所有潜在的药靶中有超过50％的蛋白为膜蛋白；另一方面 由于膜蛋白位于细菌的外部，更容易被宿主免疫系统所识别，因此这些膜蛋白可 能会成为潜在的耐药结核杆菌的诊断抗原或新的药物靶标。为进一步考察这些差 抗原性，进而利用Westernblot分析对双向电泳的结果进行了进一+步的验证。目 前『F在采集临床己知患者的血清，应用ELISA方法考察这几种蛋白作为诊断抗 原的敏感性和特异性，筛选出具有诊断价值的抗原。该研究的最终完成，将对瞅 药结核杆菌的快速诊断提供新的方法，为下…步耐多药结核杆菌的快速诊断提供 依据。 在进行结核杆菌比较蛋白质组学分析时，发现多数菌株与结核杆菌标准参考 一蛋白的不表达可能与结核杆菌的某一基因型别相关，为证实这一观点本研究选 方法对各分离株该基因的表达情况及菌株的基因型别进行分析。结果在检测的 位出现丝氨酸密码子的缺失，该基因上游．127位有一个点突变(G—A)存在， 且在双向电泳和Westernblot分析中均末见这一蛋白表达：其余7株分离株该基 失的49株结核杆菌均属于北京基因型，其余在该基因位点上无突变的7株均属 于非北京基因型。表明Rv0927c基因丝氨酸密码子的缺失与否与结核杆菌的北 京基因型别相关。因此，检测Rv0927c的141位密码子的缺失与否或检测这一 基因的表达与否可能可以作为结核杆菌北京基因型分型的一个标志。 除此雨外，本文还对结核杆菌耐药与药物外排泵的关系进行了初步探讨。为 明确药物外排泵基因在药物压力下是否过表达，本文通过应用real．timeRT-PCR 的方法对在异烟肼和利福平药物压力下耐多药菌株中5个药物外排基因Rv0783c． 转录水平有显著增高(P0．05)。表明结核杆菌耐药与～些药物外排基因的过 表达有明显的相关性。 关键词：结核杆菌：蛋白质组学