螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)基因与中风中医证型及其炎性反应的关联研究.docVIP

　　螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)基因与中风中医证型及其炎性反应的关联研究 --缺血性脑卒中在中医称“中风”#65377;中医学认为中医证型具有分子遗传基础,既往研究表明,基因的差异表达及基因序列的多态性决定了个体的差异,在临床则表现为不同的证候群#65377;螺旋环螺旋结构域扩散激酶(conserved helix-loop-helixubiquitous kinase,CHUK)基因编码的蛋白质是核因子NF-kappa-B复合物的抑制剂,可影响NF-kappa-B通路的活性,有研究表明NF-kappa-B通路参与脑卒中的病理过程[3],因此,CHUK基因可能参与脑卒中的病理过程#65377;本研究旨在分析CHUK基因在不同中风患者与对照组中的表达差异,并探讨CHUK基因多态性位点(rs3808916#65380;rs2230804#65380;rs3808917)与中风证型及炎性反应的关联性#65377; 一#65380;资料 1.资料 病例需同时符合西医诊断标准和中医诊断标准#65377;病例组来自于2009年7月至2014年6月在广西中医药大学第一附属医院中医脑病科住院的缺血性中风患者#65377;对照组来自同期的广西中医药大学第一附属医院体检中心参加健康体检的正常人以及骨科等患非神经系统疾病且病情较轻微的住院患者#65377; 2.诊断标准 西医诊断标准:参照1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的《各类脑血管病诊断要点》缺血性脑卒中诊断,均经头颅CT和/或MRI确诊,每个病例均经过至少2名主治以上职称的神经内科医师诊断一致#65377; 中医诊断标准及证候辨证分型标准:依据1996年国家中医药管理局全国脑病急症科研协作组制订的《中风病诊断疗效评定标准(试行)》#65377;每例缺血性中风患者均经2名经统一培训的主治以上职称的中医医师进行中医证候分型,若2名中医医师辨证结果不一致,则提交由3名副高以上职称的中医医师组成的专家小组讨论后确定中医证候类型#65377; 本研究选择风痰瘀阻证#65380;气虚血瘀证这两个临床上常见的中风证型进行研究,风痰瘀阻证诊断标准为:半身不遂,口舌歪斜,言语蹇涩或不语,感觉减退或消失,头晕目眩,痰多而黏,舌质暗淡,舌苔薄白或白腻,脉弦滑#65377;气虚血瘀证诊断标准为:半身不遂,口舌歪斜,言语蹇涩或不语,感觉减退或消失,面色胱白,气短乏力,自汗出,舌质暗淡,舌苔白腻或有齿痕,脉沉细#65377; 3.排除标准 病例组排除肿瘤#65380;脑外伤#65380;脑血管畸形以及心脏源性栓塞等其他原因引起的缺血性中风;合并自身免疫性疾病等严重系统性疾病者;严重心#65380;肝#65380;肾功能障碍#65377;对照组排除合并自身免疫性疾病等严重系统性疾病者;存在严重心#65380;肝#65380;肾功能障碍者;体检前2周有感染#65380;发热等炎性疾病者#65377; 4.研究对象 共纳入缺血性中风595例,包括:风痰瘀阻证311例,平均年龄(64.46±10.90)岁;气虚血瘀证284例,平均年龄(66.99±10.45)岁#65377;纳入对照605例,平均年龄(65.56±12.45)岁#65377;风痰瘀阻证患者与对照组在性别#65380;年龄上的差异均无统计学意义,气虚血瘀证与对照组在性别#65380;年龄上的差异亦无统计学意义#65377;所有对象均自我报告为广西汉族人,相互之间无亲缘关系,且均知情同意#65377; 二#65380;方法 1.实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 抽取研究对象外周静脉血2mL,置于枸橼酸抗凝管内,于采血后6h内分离血清及血细胞(3 000r/min,离心10min),血清放置于-80℃冰箱保存以备用于炎性细胞因子血清水平测定#65377;采用Trizol法(美国Invitrogen公司提供)提取外周血单核细胞中总RNA,使用PrimeScriptTM RT reagent Kit Ⅱ试剂盒(大连TAKARA公司提供)和BIO-RAD伯乐CFX96仪器按照实验步骤实行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定CHUK基因mRNA表达水平#65377; RT-PCR反应体系(总体系为20.0μL)构建如下:SYPR PremixEx Taq:10.0μL;上游引物:0.4μL;下游引物:0.4μL;cDNA模板:2μL;ddH 2 O:7.2μL#65377;PCR反应条件如下:95℃30s;95℃5s;60℃30min,40循环#65377;GAPDH和CHUK在健康对照和缺血性脑卒中的表达水平是通过2-detadetaCT计算,共完成36例缺血性中风风痰瘀阻证#65380;37例气虚血瘀证#65380;85例对照的外周血CHUK基因m