分光光度法测定维生素B1中山大学公共卫生学院.PPTVIP

分光光度法测定维生素B12 林薇薇 预防医学系 中山大学公共卫生学院 2015.4 紫外可见分光光度法知识点复习 实验目的 实验仪器及试剂 实验步骤 紫外可见分光光度法知识点复习 紫外光谱法的特征 紫外吸收光谱对应的电磁波长较短，能量大，反映分子中电子能级跃迁情况。 电子能级伴随振动能级的跃迁，电子光谱图简单，峰形宽，用来进行定性分析信号较少 常用于共轭体系的定量分析，灵敏度高，检出限低 基本原理Lambert-Beer定律 物理意义 在一定条件下，物质的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。 数学表达式：A=Kbc 是分光光度法定量分析的依据 适用条件 单色光 稀溶液 溶液均匀 紫外-可见分光光度计基本结构 紫外-可见分光光度计基本结构 紫外-可见分光光度计基本结构 紫外-可见分光光度计基本结构 紫外-可见分光光度计基本结构 紫外-可见分光光度计类型 分析条件的选择 显色反应条件的选择（测量前） 显色反应选择性好 灵敏度高 有色化合物与显色剂颜色差别明显 显色剂组成稳定 测量条件的选择（测量时） 分析条件的选择 显色反应条件的选择 测量条件的选择 测量波长 参比溶液 吸光度度数范围 定性和定量分析 定性分析 吸收曲线的特征值(λmax)及整个吸收曲线的形状 定量分析 Lambert-Beer定律 标准曲线法 比较法 多组分样品：双波长分光光度法 实验目的 掌握紫外-可见分光光度计的使用方法 学习用药物百分吸收系数进行分析的方法 紫外-可见分光光度计使用方法 开启电源，指示灯亮，仪器预热20 min。 旋动波长手轮，把所需波长对准刻度线。 将装有溶液的比色皿放置比色架中，令参比溶液置于光路。 盖上样品室盖，按MODE键，选择 “T”，按AO/100%键，调节透光率“100％T”，使数字显示为“100.0T”。（如显示不到100％T，则可加按一次。 吸光度A的测量：仪器调T为100％后，将选择开关转换至A调零旋钮，数字显示应为“.000”。然后拉出拉杆，使被测溶液置入光路，数字显示值即为试样的吸光度A。 测定完毕后，先打开样品室盖，再断电源。比色杯应清洗干净后，再贮放保存。 实验步骤 1. 配制Vit B12测试液 取一支500μg/ml VitB12注射液用移液枪吸取500 μL于10mL比色管中，用蒸馏水稀释至刻度（即稀释20倍），制得VitB12测试液 2. 测定Vit B12测试液吸光度 将VitB12测试液装入1cm石英吸收池中，以蒸馏水作参比，在361nm波长处和550nm波长处分别测得吸收光度A，计算出VB12标示量的百分比 3.结果记录及计算 定性： 定量 4. 讨论与思考 《中国药典》规定维生素B12注射液的正常含量应为标示量的90.0%～110%。根据本实验结果，判断是否符合要求？ 本实验是否可以用玻璃比色皿？在紫外分光光度计上，还有其他方法能测定其含量吗？试举一例并设计实验。 实验报告要求： 不仅写出结果，还要写出运算过程 * 紫外可见光谱是波长在多少nm内的电磁波？ 紫外可见光谱法是吸收光谱还是发射光谱？ 紫外可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收200-800nm光谱的辐射来进行分析测定的方法 判断： 摩尔吸光系数ε大小与溶液浓度和液层厚度无关？ 用吸收峰对应的摩尔吸光系数ελmax值评价分光光度法灵敏度，值越大，分析方法灵敏度越小？ 光源：提供激发能，供待测分子吸收。要求能提供足够强的连续光源 可见光区：钨灯或卤钨灯 紫外光区：氢灯或氘灯 判断： 波长200-400nm的电磁波谱称为可见光？ 显示系统 光源 单色器 吸收池 检测器 单色器：将从光源发出的光分离出所需要的单色光 棱镜：玻璃或石英。色散后光谱波长分布不均 光栅：波长范围广，色散均匀，分辨性高，使用方便 显示系统 光源 单色器 吸收池 检测器 吸收池：用于盛放溶液。 可见光区：玻璃池，石英 紫外区：石英 显示系统 光源 单色器 吸收池 检测器 检测器：检测光信号，并将光信号转变成电信号 最常用的是光电倍增管 显示系统 光源 单色器 吸收池 检测器 显示系统：将检测器输出信号经处理转换成透光度和吸光度再显示出来 显示系统 光源 单色器 吸收池 检测器 光源 单色器 吸收池 检测器 检测器 光源 单色器 切光器 吸收池 检测器 光源 单色器1 切光器 吸收池 切光器 单色器2 单光束 双光束 双波长 判断： 影响显色反应的因素 a.显色剂用量 b.溶液酸度 c.溶液温度 d.气压 e.显色时间 f.共存的干扰离子 判断： 测量波长选择时，一般选择最小吸收波长 判断： 紫外-分光光度法在测量时需要考虑测量波长、吸光度读数范围、参比溶液等测量