第18章 高效液相色谱法.ppt

第20章 高效液相色谱法 20.1 概述 20.2 高效液相色谱仪 20.3 液相色谱分离分析法 20.4 高效液相色谱固定相和流动相 20.1 概述 一、高效液相色谱的特点 二、高效液相色谱的分类 分析对象 气相色谱：气体和沸点较低的化合物，占有机物总数20% 高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，占有机物总数80% 一、高效液相色谱的特点 高压： 150 - 350 ?105 Pa 高速： 一般 1 h, 1min. 高效： 柱效高 高灵敏度： 10-9 g（紫外检测器） 10-12 g（荧光检测器） 二、高效液相色谱的分类 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱 疏水作用色谱 (2) 梯度淋洗装置 (3) 进样装置 (4) 高效分离柱 (5) 液相色谱检测器 b. 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器 d. 荧光检测器 一、 液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 二、 液-液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 三、 离子交换色谱ion-exchange chromatography 四、 离子对色谱 ion pair chromatography 定义：把离子对试剂加入到极性流动相中，被测组分与其中离子对试剂的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。 适用：可离子化或离子型化合物，如有机酸、碱、盐的分离。 机理：试样在流动相中与离子对试剂离解出的反离子生成不荷电的疏水离子对，然后溶解或吸附在疏水固定相上，使得中性离子对在固定相和流动相中达成分配平衡。 五、 排阻色谱size- exclusion chromatography 六、 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph 正相色谱 低极性流动相 反相色谱 高极性流动相 中等极性流动相 中等极性流动相 时间 时间 时间 时间 待测物极性：ABC 正、反相色谱中极性和保留时间的关系 应用实例（芳香烃） 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 用离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。 离子交换分离原理 溶液pH值调控固定相电荷，溶液离子强度调控静电作用 应用实例：稀土离子分离 反相离子对色谱：固定相一般为烷基键合硅胶固定相，如ODS 1.去甲肾上腺素 2.肾上腺素 3.多巴胺 IS: 3,4-二羟基苯甲胺 固定相：C8 流动相：含辛基硫酸钠的缓冲溶液+甲醇 尿中儿茶酚胺类化合物的分析 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 分离原理 应用实例（苯乙烯寡聚体） 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 * * 流动相 气相色谱：对组分没有亲和力的惰性气体，对分离选择性几乎无影响 高效液相色谱：可选用不同极性的液体；选择余地大；对分离影响大（与组分或固定相均作用） 色谱柱温 气相色谱：一般较高 高效液相色谱：通常为室温 高效液相色谱 vs 气相色谱 成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂； 缺少灵敏度高的通用型检测器； 复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱； 受压易分解或变性的