HPLC在植物有效成分检测中的应用.docVIP

HPLC在植物有效成分检测中的应用 【实验目的】 1、了解高效液相色谱仪的基本原理； 2、掌握利用高效液相色谱仪对样品组分的分离鉴定； 3、熟练操作软件，对获得的数据进行分析处理。 【实验仪器、试剂与材料】 ①实验仪器：LabAlliance液相色谱仪，超声波清洗器，； ②试剂、材料：乙腈（分析纯），超纯水，姜黄素。 ③色谱条件；色谱柱：Kromasil C18 5um 100A0 250*4.6mm；流动相：乙腈︰水=45︰55，加10.6％的冰乙酸；流速：1mL/min；检测器：紫外420nm；柱温：35℃；进样量：20μL 【实验原理】 Ⅰ色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法：使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。 2．液液色谱法：使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 3．离子交换色谱法：固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4．离子对色谱法：又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 5．排阻色谱法：固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 ⅡHPLC系统 HPLC系统一般由输液、进样、、检测、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。 泵的构造和性能 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。 模式切换（PSI，流速，最高压力，最低压力）：用流速调节键来调节其大小。 泵上装有入口单向阀、自清洗单向阀。自清洗：因低压溶剂蒸发出结晶盐，损伤密封圈，系统配有自清洗装置，避免盐结晶，提高泵的寿命。自清洗液中可加入甲醇，避免长菌。夏季一个月更换一次，冬季为一个半月。 旁通阀：用于抽出流动相中的气体，避免气体进入，以不漏为目的，不可拧太紧。 2、 早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。 一般HPLC分析常用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项：样品溶液进样前必须用0.45滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能