实验25动物细胞线粒体及线粒体DNA的制备.docVIP

实验25 动物细胞线粒体及线粒体DNA的制备、酶切图谱分析 实验目的： 了解并掌握细胞线粒体(mitochondria)的提取原理及操作方法；了解线粒体DNA的限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术的原理及操作方法。 实验原理： 线粒体是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 1、 线粒体的获得 细胞器的游离：细胞器的游离需要破碎细胞，破碎细胞常用的方法有化学法和机械法。化学法有渗透压作用、酶水解、自溶、冻融等几种类型。渗透压作用是利用低表面张力使细胞膜破碎，其作用温和。自溶法是利用生物自生的活细胞内含有各种大量的消化酶，它们能将细胞膜溶解掉，同时也可能将线粒体膜溶解而使线粒体DNA释放出来。冻融法是利用冻结和溶解的双重作用，其作用可能会造成细胞膜和有膜结构的细胞器的破裂，其作用较为剧烈。 机械法有研磨破碎、均质机破碎、超声波破碎和匀浆器破碎。研磨破碎是利用盘磨研磨剪切破碎，作用中等。均质机破碎是用电带动刀片进行剪切组织器官，其作用较剧烈，基本能够将组织器官破碎。超声波破碎是随机地将组织细胞打成各种大小不同的片段，其作用非常剧烈。匀浆器破碎是一种手动的方法，由于匀浆器容器壁较为粗糙，通过相互的摩擦，基本能将细胞膜磨破，其作用温和。要获得较为完整而大量的线粒体，通常用STE抽提缓冲液浸泡材料并用玻璃匀浆器或研钵研磨破碎。 线粒体的粗提：由于动物细胞的线粒体较小15~19kb），而真核细胞及其碎片、蛋白质沉淀物都比较大，所以用差速离心的方法可以将它们分离开来。差速离心法又叫分级离心法，是当非均一粒子(大小、密度各不相同)的悬浮液被离心时，各种粒子将以各自的沉降速率移至离心管底部，逐步在管底形成沉淀。为了分出特定组分，需进行一系列离心。首先选择一个离心速度和离心时间，第一次离心时把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。这时所需要的组分大部分还留在上清液中，又选择第二个离心速度和离心时间，使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。去掉上清液后，添加相同介质把沉淀悬浮起来，重复上述的差速离心，反复几次，直至达到所需要的粒子纯度为止。一般去细胞碎片及杂质的离心力(500~2000g)和离心时间(5~15min)，沉淀线粒体的离心力(12000~20000g)和离心时间(20~40min)。 2、线粒体的鉴定 JanusGreen B是对线粒体专一的活染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上，内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色，而在胞质内，染料被还原成无色。线粒体浸没在JanusGreen B中能维持活性数小时，可直接观察到生活状态线粒体的外形、分布及运动。线粒体制品经JanusGreen B特意染色后，光学显微镜下放大100倍镜检能够发现是否有线粒体存在及它的大小、形状、数量、结构。必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C氧化酶才能够把詹纳斯绿B氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于０～４的冰水浴低温中，并且操作要迅速。3、动物线粒体DNA（mtDNA）的提取方法 线粒体DNA(mtDNA)是一封闭的双环状分子，动物线粒体DNA为15~19kb。动物线粒体DNA具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点，已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究。 SDS裂解结合蛋白酶K的提取mtDNASDS（十二烷基硫酸钠)破坏线粒体膜使蛋白质变性，从而游离出核酸，EDTA抑制细胞中DN活性，蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽加入饱和乙酸钠后，绝人部分线性大分子DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀，环状mtDNA仍为自然状态，通过高速离心，即可得到mtDNA。高盐沉淀法操作简单，易重复，产量多，可依需用量扩大反应体系，使mtDNA质量得以容易控制。 4、mtDNA的检测 检测线粒体DNA浓度和纯度通常有3种方法，即琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和紫外分光光度计(UV)。琼脂糖凝胶电泳可以通过泳带颜色的深浅来判断其浓度，通过是否有拖带来确定其纯度，还可以通过分子量标记来确定DNA的大小。限制性内切酶酶切可以知道是否为基因组，如果是基因组，则不能酶切出清晰的条带来如果没有基因组污染，只要该DNA存在此酶切位点，就会酶切出条带来。紫外分光光度计可以测得A260和A260/A280，其中A260越大，其DNA的浓度也越大，反之越小A260/A280一般介于1.6~2.0之间，如果A260/A2802.0，则此DNA可能有RNA污染，A260/A2801.6，则此DNA可能有蛋白质、酚、