灵芝三萜抑制炎症反应的研究.docVIP

灵芝三萜抑制炎症反应的研究 摘要：灵芝（Ganoderma lucidum）是一种著名的药用蘑菇，做为传统中药用于预防和治疗多种疾病。本研究中我们评估了在脂多糖激动巨噬细胞过程中灵芝中提取的三萜的抗炎作用。主要表现在灵芝三萜显著地抑制脂多糖激动鼠RAW264.7细胞中炎症分泌物细胞因子的生成，如肿瘤坏死因子和白细胞介素-6，和炎症介质NO和前列腺素E2。灵芝三萜也能减少RAW264.7细胞中依赖脂多糖的iNOX和COX-2的表达。灵芝三萜的抗炎作用调节通过减少NF-κB-DNA结合活性来抑制转录因子NF-κB，灵芝三萜在脂多糖激动巨噬细胞过程中抑制了p65的磷酸化。再者，灵芝三萜抑制脂多糖AP-1-DNA结合活性并减少AP-1子单元 c-jun的表达。另外，灵芝三萜通过降低脂多糖诱导的ERK1/2 和JNK的磷酸化来抑制MAP激酶的活性，而不是通过抑制p38来实现。体内实验明显的表现出灵芝三萜也能抑制脂多糖诱导的内毒素小鼠体内巨噬细胞中肿瘤坏死因子和白细胞介素-6的生成。灵芝三萜除了具有抗炎活性外，灵芝三萜还能通过抑制细胞循环G0/G1–G2M来抑制RAW264.7细胞增殖，G0/G1–G2M的抑制是通过降低细胞循环调节蛋白活性来介导的，这些调节蛋白分别是细胞周期蛋白D1，CDK4和细胞周期蛋白B1。总之，灵芝三萜抗炎和抗增殖作用是通过抑制巨噬细胞上NF-κB 和AP-1信号通道来介导的。 关键词：巨噬细胞；炎症；灵芝；三萜；细胞因子；信号转导作用 1.前言 炎症是一些疾病内在的发病机理。巨噬细胞是人们熟知的炎症反应过程中一种重要的免疫调节细胞。激活的巨噬细胞能分泌一些不同的炎症介质，包括肿瘤坏死因子，白细胞介素-6，ROS，前列腺素E2和NO[1-3]。这些介质过度的或不受调控的生成能介导或恶化一些疾病，包括风湿性关节炎，骨关节炎，败血症，慢性肺炎，结肠溃疡和致癌作用。最近，已经有报道证明了巨噬细胞中的炎症刺激物能促进肿瘤的生长[4-6]，相反减少巨噬细胞能抑制肿瘤的生长[6]。临床研究表明在一些不同类型的固体肿瘤中肿瘤间质中巨噬细胞密度的增大与不健康的预后表形出显著地相互关联[7-9]。因此，在治疗炎症疾病和癌症过程中抑制这些炎症细胞的活性和增殖显然成为小分子药物的一种重要的治疗目标。在这种观点下，评估各种具有生物活性的植物成分的抗炎作用已经受到了广泛的重视。灵芝蘑菇是这些药用植物中的一种，其在亚洲国家中普遍用来治疗多种疾病[10]和做为传统中药用于家庭治疗已经拥有超过2000年的历史[11]。在已经报道的灵芝的生物活性和药理活性中，灵芝的抗肿瘤活性引起了人们特殊的兴趣。灵芝抗肿瘤活性的体内和体外实验研究已经证明其能够应用于预防和治疗癌症[12，13]。多糖和三萜是灵芝中两种主要的生物活性成分，以前发现多糖主要是通过免疫调节机制来产生作用[14，15]，而三萜是直接抑制癌症细胞生长和侵染癌症细胞[10，16，17]。虽然已经报道了灵芝多糖和灵芝三萜具有很多生物活性和药理作用，但没阐述过灵芝三萜抗炎活性的分子机制。为了进一步理解灵芝三萜的抗炎作用，我们研究其在由革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖刺激的鼠巨噬细胞RAW264.7中的抗炎作用。脂多糖是通过通过一些转录因子如AP-1和NF-κB作用于受体-4加强一些炎症物质的表达来产生活性，例如肿瘤坏死因子，白细胞介素-6，iNOX和COX-2[18]。AP-1和NF-κB的活性是由多种MAP激酶来调节的，包括ERK1/2，p38MAP激酶和JNK，和介导NF-κB转入细胞核的IKKs[18-22]。 本研究中，我们评估了灵芝三萜在巨噬细胞RAW264.7中的作用。这里，主要表现在灵芝三萜抑制多种炎症介质的产生和诱导抑制细胞循环。这些结果表明灵芝三萜可以用来做为一种抗炎和抗增殖药物。 2.材料与方法 2.1灵芝三萜的制备与鉴别 灵芝三萜购于pharmanex公司。提取物按以下步骤制备：将灵芝蘑菇粉碎并用95%甲醇逆流提取。甲醇提取物减压浓缩成干燥物。甲醇提取物用HPLC分析，条件为C-18柱用乙腈-0.1%三氟醋酸ganoderic acid A， F，H，Mh，S1，ganosporeric acid，lucidenic acid B，D，D1，E1，L，and methyl lucidenate G2–3×106RAW264.7细胞培养在温度为37℃湿度较大含有5%氧化碳的环境下。对于整个实验，细胞生长到群体的80%-90%。用1ug/ml脂多糖刺激RAW264.7细胞。细胞在24小时内产生带有或没带有灵芝三萜在浆液媒介然后用暴露在脂多糖中24小时。 2.3NO产量测定 RAW264.7细胞用灵芝三萜预处理24小时后在脂多糖溶液中培养24小时。收集基质并用N含量法确定NO的产量。培